Способ лечения миастении гравис путем трансплантации гемопоэтических клеток аутологичного костного мозга

(51) 61 35/28 (2006.01) 61 21/04 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ гемопоэтических стволовых клеток, обладающих естественной иммуносупрессивной активностью и обеспечивающих устранение иммунного дисбаланса организма. По данной методике предложена трансплантация аутогенных гемопоэтических стволовых клеток с целью коррекции иммунного дисбаланса с помощью иммунорегуляторных веществ (, -, ИЛ-10 и др.) в комплексе патогенетической терапии. Реинфузия ГСК способствует замещению дефектной ткани или заполнению генетически модифицированными клетками пустующей ниши,результатом чего становится компенсация функционального дефекта. Таким образом, трансплантация аутогенных клеток костного мозга с помощью нативныхиммунорегуляторных пептидов с высокой биологической активностью может устранить иммунный дисбаланс и восстановить адекватные адаптационные реакции организма. Преимуществом метода является аутогенность,биобезопасность в плане онкогенности, ввиду использования клеточного материала аутологичного костного мозга.(72) Аскаров Манарбек Бапович Жусупова Алмагуль Сейдуалиевна Байгенжин Абай Кабатаевич Кожаканова Сайран Темиргалиевна Жакупова Айгерим Хайруллаевна Казбекова Айжан Рахимкановна(73) Акционерное общество Национальный научный медицинский центр(56) Гехт Б.М., Кузин М.И., Коломенская Е.А. и др. Патогенетическая терапия заболеваний нервной системы и мышц большими дозами преднизолона через день//Журнал невропатологии и психиатрии им. С.С. Корсакова., 1979, т. 79, 3(54) СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ МИАСТЕНИИ ГРАВИС ПУТЕМ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ КЛЕТОК АУТОЛОГИЧНОГО КОСТНОГО МОЗГА(57) Изобретение относится к медицине, а именно к неврологии. Метод предложен для применения в комплексном лечении миастении гравис. Задача изобретения - разработка способа лечения миастении гравис с применением аутологичных Изобретение относится к медицине, в частности к неврологии, и затрагивает проблемы лечения такой нозологии как миастения гравис. Миастения гравис (МГ) - классическое аутоиммунное заболевание нервной системы, при котором ведущий клинический синдром патологической мышечной утомляемости обусловлен явлениями аутоагрессии с образованием антител,направленных к различным антигенным мишеням периферического нейромоторного аппарата.(Сепп Е.К., Ланцова В.Б. Миастения. Клиника,диагностика, лечение и патофизиология. М., 2002.). В настоящее время лечение миастении гравис основано на изучении патогенеза заболевания и включает в себя использование различных лекарственных препаратов и тимэктомию. В зависимости от тяжести клинической картины,длительности заболевания и возраста пациента применяются один или другой методы или их комбинации. У многих пациентов с миастенией гравис,аутоантитела,полученные против рецепторов для нейромедиатора ацетилхолина (АХ) в нервно-мышечном соединении, приводят к таким симптомам, как нарушение зрения, хроническая усталость мышц и затрудненное дыхание. Более того, применение некоторых препаратов в очень высоких дозах может вызвать тяжелый криз,который может довести до паралича дыхательных мышц, угрожающего жизни больного. Очень важным подходом для общего лечения миастении, является раннее удаление вилочковой железы (тимэктомия). С помощью этой операции,особенно у молодых пациентов, с небольшой давностью заболевания и средней тяжестью клинической картиной, достигается значительное улучшение состояния. Другим методом лечения миастении гравис является плазмаферез. После того,как было обнаружено, что слабость мышц при миастении гравис имеет место из-за циркулирующих антител к рецепторам ацетилхолина, были разработаны методы для их быстрого удаления из плазмы. Однако, плазмаферез является слишком сложным и дорогостоящим методом лечения. В последние годы в практику внедряется лечение человеческим иммунноглобулином. Препарат содержит большое количество иммунноглобулинов классас широким спектром антител, который соответствует таковому в популяции в целом. Недостатком метода является наличие побочных эффектов системного характера и дороговизна. По мере внедрения терапии человеческим иммунноглобулином стоимость лечения миастении достигла от 98000 до 320000 долларов США. Наиболее близким аналогом терапевтического подхода является применение иммуносупрессантов. Совпадающий признак с нашим методом заключается в иммуносупрессивной направленности терапии. Эти препараты часто эффективны для лечения миастении,однако,нежелательным побочным эффектом такого лечения является подавление и других функций иммунной системы. 2(Гехт Б.М., Кузин М.И., Коломенская Е.А. и др. Патогенетическая терапия заболеваний нервной систем и мышц большими дозами преднизолона через день // журнал невропатологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 1979. Е 79. 3.) Кроме того,такие методы терапии являются неспецифическими и могут вызвать побочные эффекты и увеличить восприимчивость к инфекциям и раку. Надо также отметить, что лекарственные средства не лечат миастению гравис, а оказывают влияние на улучшение ее симптоматики. Недостатком этих способов является то, что лечение миастении представляет большие трудности в связи со сложностью купирования миастенических симптомов,недостаточной эффективностью применения антихолинэстеразных и иммунодепрессантных препаратов,вследствие развития резистентности к ним и рядом побочных осложнений медикаментозной терапии и дороговизны экстракорпоральных методов.(Гехт Б.М., Санадзе А.Г., Ипполитов И.Х.,Сиднев Д.В., Меркулова Д.М, Щербакова Н.И.,Середкин Е.А., Гуркина Г.Т., Соколова В.И.,Примеров В.Н, Павлова И.Г. Лечение кризов при миастении. -М., 2000.). По мнению большинства экспертов одним из наиболее перспективных направлений в лечении аутоиммунных заболеваний на сегодняшний день является клеточная трансплантация. В качестве альтернативного подхода к текущей терапии выступают методы лечения, которые смогут блокировать аутореактивность без ущерба для общего иммунитета. В последние годы, весьма обнадеживающие результаты при лечении иммунноопосредованных заболеваний дает применение стволовых клеток. (Шевченко Ю.Л., Бойцов С.А., Лядов К.В.Концепция клеточной терапии аутоиммунных заболеваний/ТРоссийские медицинские вести - 2004 г- Т.9, 2). Так метод трансплантации стволовых клеток при аутоиммунных заболеваниях нервной системы начали изучать в США и Европе с середины 90-х годов прошлого столетия. В России первая трансплантация стволовых клеток в неврологической практике выполнена в 1999 году под руководством проф. А.А. Новика. К 2009 году в мире сделано более 700 операций трансплантации стволовых клеток при иммунно-опосредованных заболеваниях нервной системы.(Новик А.А.,Иванов Р.А. Клеточная терапия.М. МИА 2008 г). В последнее время, в ряде исследований сообщается, что стволовые клетки (СК) костного мозга способны подавлять пролиферацию человеческих мононуклеарных клеток периферической кровии 4 -клеток. (,,.//. .-2009.- 4). В ряде исследований доказано, что стволовые клетки являются мощным средством в иммуномодуляции что функционирование СК исправляет иммунные расстройства в ряде иммунных заболеваний. Кроме того, СК способны модулировать функции других иммунных клеток, таких как естественные клеткикиллеры, дендритные клетки и В-клетки. Таким образом,СК потенциально могут быть использованы для иммуномодуляции и коррекции нарушений иммунного гомеостаза при таких болезнях, как миастения гравис. Сущность клеточной терапии,как терапевтического вмешательства, основана на модификации генетического материала живых клеток. Согласно определению(,правительственная организация, осуществляющая лицензирование медицинских технологий и препаратов в США),клеточная терапия - это использование живых клеток различного происхождения, которые при введении в организм пациента способны к активному функционированию, результатом чего являются улучшение или модификация существующей функции органа или ткани, либо восстановление или замена утраченной функции. Преимуществом трансплантации аутологичных стволовых клеток является использование собственных клеток пациента, поскольку именно они имеют наибольшие шансы для функционирования в организме в силу отсутствия отторжения его иммунной системой. (Новик А.А.,Богданов А.Н. принципы трансплантации костного мозга и стволовых клеток периферической крови. СПб. Военно-медицинская академия, 2009 г.) В данном изобретении мы предлагаем использовать гемопоэтические клетки,которые являются гетерогенной популяцией и помимо мультипотентных стволовых клеток включают более дифференцированные клетки, являющиеся предшественниками различных ростков кроветворения и эндотелиальных клеток. Клетки подвергшиеся экстракорпоральной генетической модификации, могут служить средствами доставки продуктов внедренного гена в патологический очаг. Реинфузия таких клеточных препаратов может способствовать замещению дефектной ткани или заполнению генетически модифицированными клетками пустующей ниши, результатом чего становится компенсация функционального дефекта. Трансплантируя аутогенные клетки костного мозга с помощью нативных иммунорегуляторных пептидов с высокой биологической активностью можно устранить иммунный дисбаланс и восстановить адекватные адаптационные реакции организма. Задачей изобретения определялась разработка способа лечения миастении гравис с применением аутологичных гемопоэтических стволовых клеток,обладающих естественной иммуносупрессивной,иммуномодулирующей активностью и обеспечивающих устранение иммунного дисбаланса организма. Методика трансплантации гемопоэтических клеток аутологичного костного мозга. В асептических условиях операционного блока пациент находится в положении лежа на спине. Процедура забора костного мозга осуществляется под местной анестезией .2 - 10,0 и . 0,5 - 10,0 из задних гребней подвздошной кости, в объеме до 400 мл. Далее,аспират костного мозга фракционировали методом центрифугирования на фиколле(плотность 1077 г/л), отбирали мононуклерную фракцию. Отобранный клеточный материал отмывали от фиколла питательной средой(. Новая Зеландия) методом центрифугирования,клеточный осадок помещали в среду для культивирования, содержащую(,Новая Зеландия), 20(Аргентина) и 100 мкг/мл пенициллина. Содержание гемопоэтических стволовых 34 клеток, по данным проточной цитофлуориметрии составляло от 78 до 97. Затем клетки высевали на посуду для культивирования с плотностью 1,29102 кл/см 2. Клетки культивировали в течении от 24-72 час при 37 С в инкубаторе, в атмосфере с 5 СО 2 и с 95-ной влажностью. Культивирование клеток проводили с целью устранения дизрегуляторного влияния на них аутоиммунного процесса в организме. Введение клеточной суспензии проводилось однократно системно (внутривенно) в 200 мл 0,9 , в количестве от 97 до 126 млн. клеток. Периодичность трансплантации не чаще 2 раз в год. Результаты трансплантации гемопоэтических клеток аутологичного костного мозга Эффективность применения гемопоэтических клеток аутологичного костного мозга осуществлялась, при помощи оценки клинических данных и лабораторных иммуннологических показателей. Оценка неврологического статуса осуществлялась по шкале предложеннойпозволяющей определить степень выраженности двигательных расстройств. Для объективной оценки тяжести клинических проявлений миастении использовалась Международная количественная шкала , предложенная (1998 г.). Количественный диапазон данной шкалы составляет от 0 баллов(отсутствие каких либо глазодвигательных и бульбарных нарушений, а также полная ремиссия) до максимально возможных 39 баллов(наибольшая выраженность глазодвигательных и бульбарных нарушений, а также мышечной слабости).Иммунологическое исследование крови включало определение антител к холинорецепторам, являющихся качественным критерием диагностики аутоиммунной миастении. А также проведены лабораторные исследования по определению спектра 4, СД 25 - являющихся белковыми молекулами, которые представляют собой основные субпопуляции Т-лимфоцитов, так называемых, клеток-регуляторов специфических по антигенной направленности иммунных реакции гуморального и клеточного типа. Увеличение численности 4, СД 25 после применения клеточной терапии способствует подавлению активности остаточных патологических клеток. Исходный диапазон баллов по этой шкале в контрольной группе до начала лечения составил 3 20,908,94, и в группе с применением аутологичных клеток костного мозга -21,608,05. После применения клеточных технологий во временном отношении через 3 и 12 месяцев диапазон балльной оценки составил в контрольной группе 21,009,66 и 20,709,98, в группе с применением аутологичных клеток костного мозга 19,007,48 и 18,608,08 соответственно. Таким образом,выявлена достоверно значимая клиническая динамика в основной группе (р 0,05), с уменьшением показателей бальной оценки клинической тяжести заболевания. При анализе динамики иммунологических параметров у больных миастенией после клеточной трансплантации в течении одного года изменения были выявлены как в гуморальном, так и в клеточном звене иммунитета. При изучении показатель СД 4 пациентов основной группы с применением трансплантации гемопоэтических клеток до начала лечения составил 36,309,01. Исходные же показатели СД 25 составили 21,052,37, при дальнейшем анализе через 3 месяца уровень СД 4 составил 35,799,53, СД 25 составил 20,852,99. После применения гемопоэтических клеток аутологичного костного мозга в течении 12 месяцев наблюдалась тенденция к снижению показателей СД 4 34,058,44 и СД 25 - 20,410,83.,что свидетельствовало о снижении иммунологической активности и подтверждалось клиническими данными. Таким образом,применение метода трансплантации костно-мозговой взвеси гемопоэтических клеток костного мозга в комплексном лечении МГ показал улучшение клинических данных по шкале количественной оценки тяжести заболевания. Согласно классификации . ., предложенной в 1998 г., (по оценочной шкале тяжести клинических проявлений) в основной группе наблюдалось клиническое улучшение с переходом с 3 А в 2 В у 4 пациентов (т.е. уменьшение мышечной слабости скелетной и бульбарной мускулатуры от средней степени тяжести до легкой степени) и 2 А(уменьшение мышечной слабости скелетной мускулатуры и купирование слабости бульбарной мускулатуры) у 2 пациентов. В течении наблюдаемого периода ухудшений, кризовых состояний у пациентов обеих групп отмечено не было. Наряду с этим отмечалась хорошая переносимость процедуры. Полученные данные свидетельствовали о статистической достоверной положительной клинической динамике с уменьшением показателей бальной оценки тяжести заболевания, отсутствии обострений заболевания в течении наблюдаемого периода. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ лечения миастении гравис,отличающийся тем, что используют аутологичные кроветворные стволовые клетки внутривенной одномоментной трансплантацией в дозе 97-126106 клеток в 200,0 мл 0,9 не чаще 2 раз в год. 2. Способ по пункту 1 аутологичные кроветворные стволовые клетки предварительно культивируют в течении 24-72 часов в условиях инкубатора, в атмосфере с 5 СО 2 и с 95-ной влажностью.