Способ определения специфичности реакции стимулированной лейкергии в присутствии хрусталикового антигена in vitro при прогнозировании катаракты радиационного генеза, у лиц подвергшихся влиянию малых доз ионизирующего излучения.

(51) 01 33/48 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ аллергена в определенной пропорции,подсчитывают число агломерированных лейкоцитов и сравнивают с таковым в контроле. Реакция считается положительной, если в опыте показатель агломерации в присутствии стимулятора, антигена хрусталика на 1/3 выше, чем в контроле (показатель нормы индекса лейкергии - 1,00,2). Цель исследования методология дифференцированной диагностики катаракты радиационного генеза в присутствии стимулированной лейкергии с использованием антигена хрусталика. Сущность изобретения определение специфичности,т.е. наличия аутосенсибилизационного процесса реакции стимулированной лейкергии в присутствии хрусталикового антигена для расширения возможностей дифференциальной диагностики катаракты радиационного генеза, при воздействии малых доз ионизирующего излучения. Предлагаемое исследование с положительным результатом апробировано на 62 пациентах,мужского пола, в возрасте от 40-60 лет,подвергшихся воздействию малых доз ионизирующего излучения, в 1986-1989 гг. и может быть использовано в офтальмологии,радиобиологии и иммунологии. Исследование расширяет возможности дифференциальной диагностики катаракты радиационного генеза.(72) Казымбет Полат Казымбетович Бахтин Мират Мухамедкаримович Ельтокова Маншук Хайлуллиновна Каирова Мархабат Жайлауовна Чернышева Анна Васильевна(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧНОСТИ РЕАКЦИИ СТИМУЛИРОВАННОЙ ЛЕЙКЕРГИИ В ПРИСУТСТВИИ ХРУСТАЛИКОВОГО АНТИГЕНА ПРИ ПРОГНОЗИРОВАНИИ КАТАРАКТЫ РАДИАЦИОННОГО ГЕНЕЗА,У ЛИЦ ПОДВЕРГШИХСЯ ВЛИЯНИЮ МАЛЫХ ДОЗ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ.(57) Область изобретения - относится к медицине, а именно к офтальмологии, радиобиологии и иммунологии и может быть использовано в уточнении лучевого катарактогенеза в отдаленном периоде у лиц, получивших малые дозы ионизирующего излучения (техногенная авария). Реакция стимулированной лейкергии основана на феномене агломерации лейкоцитов под воздействием специфического аллергена в нитратной крови по Флеку. В окрашенной толстой капле периферической крови, в присутствии Область изобретения - относится к медицине, а именно к офтальмологии, радиобиологии и иммунологии и может быть использовано в уточнении лучевого катарактогенеза в отдаленном периоде у лиц, при воздействии малых доз ионизирующего излучения (техногенная авария). Реакция стимулированной лейкергии основана на феномене агломерации лейкоцитов под воздействием специфического аллергена в нитратной крови по Флеку. В окрашенной толстой капле периферической крови, смешанной с аллергеном в определенной пропорции,подсчитывают число агломерированных лейкоцитов и сравнивают с таковым в контроле. Реакция считается положительной, если в опыте показатель агломерации в присутствии стимулятора, антигена хрусталика на 1/3 выше, чем в контроле (показатель нормы индекса лейкергии - 1,00,2). Уровень изобретения - известен способ изучения явления спонтанной лейкергии в патогенезе гемодинамических расстройств при профинтоксикациях, в частности, при токсическом действии ксенобиотиков (Л.А. Могиленкова,В.Р. Рембовский 2006, Токсический вестник 5,с.8-13). Известен способ постановки реакции стимулированной лейкергии при диагностике черепно-мозговой травмы, в котором в качестве антигена взят экстракт мозга. Наиболее выраженная стимуляция обнаружена после ушиба мозга тяжелой степени.(И.Э. Детлав. 1980,Ортопедия,травматология и протезирование 3, с.44-47.). Впервые реакцию стимуляцию лейкергии органным антигеном используя в этих целях ткань печени провел Х.М. Векслер (Векслер Х.М. - Вопросы общей реактивности организма. Сб. науч. работ. Вып.6. Таллин. 1967. с.277-285.).Реакция нашла более широкое применение в эксперименте, чем в клинической практике. Все выше перечисленные аналоги иммунологических исследований не являются специфичными для уточнения лучевого катарактогенеза, В доступной литературе не выявлены прототипы заявляемого изобретения,сообщающие о постановке реакции агломерации лейкоцитов в периферической крови, после стимуляции антигенами хрусталика у лиц, с катарактой получивших малые дозы радиации. Цель изобретения методология дифференцированной диагностики катаракты радиационного генеза в присутствии стимулированной лейкергии с использованием антигена хрусталикаСущность изобретения определение специфичности,т.е. наличия аутосенсибилизационного процесса реакции стимулированной лейкергии в присутствии хрусталикового антигена для расширения возможностей дифференциальной диагностики катаракты радиационного генеза, при воздействии малых доз ионизирующего излучения. Технический результат предлагаемого нами способа достигается следующим образом в две преципитационные пробирки с 0,05 мл 3,8 2 раствора лимоннокислого натрия вносится по 0,2 мл крови, взятой из пальца пациента с катарактой неясного генеза, в одну из них (опытную) добавляют 0,1 грамм экстракта хрусталика,перемешивают и ставят на 2 часа в термостат при температуре 37 С. После этого из содержимого пробирки готовят препарат толстой капли,высушивают и окрашивают метиленовым синим(0,01 раствор). В каждой пробе крови под микроскопом подсчитывают 1000 лейкоцитов,помечая склеенные в конгломераты по 3 и более клеток. Далее высчитывают процент лейкоцитов,склеенных в конгломераты(норма индексалейкергии - 1,00,2, см.далее). Разница полученных величин из пробирки с антигеном и без него указывала на стимуляцию агломерации хрусталиковым антигеном. В качестве антигена используется экстракт из ткани хрусталика, полученный по стандартной технологии хирургическому методу экстракапсулярная экстракция катаракты Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. - М., 1985. с.536 Методы практической биохимии / под ред. Б. Уильямса,К. Уилсона. - М. Мир, 1978. с.273 Т.А. Бирич,Л.Н. Марченко, А.Ю. Чекина/ Офтальмология,Вышэйшая школа, 2007,978-985-06-1298-4.Полученный экстракт хранится в холодильнике при температуре - 4 С и может бытьиспользован в течение 6 месяцев. Предлагаемый способ определения специфичности реакции стимулированной лейкергии в присутствии хрусталикового антигена при диагностике катаракты радиационного генеза,может быть применен в практическом здравоохранении, т.к. информативен и ресурсно целесообразен в диагностическом аспекте. Существующие методы определения адгезивных свойств клеток, основаны на дорогостоящих и сложных процедурах выделения адгезивных структур определенных видов клеток крови,требуют специальной аппаратуры, химреактивов,оборудования и специально подготовленного персонала. Во многих случаях такая громоздкая процедура определения адгезивных свойств лейкоцитов является излишней и при отсутствии необходимости изучения тонких механизмов межклеточных взаимодействий. Предлагаемый нами метод является достаточно информативным для суждения об адгезивных свойствах различных видов лейкоцитов в уточнении лучевого катарактогенеза у лиц, получивших малые доза радиации, т.к. дифференциальная диагностика инволюционной катаракты и катаракты радиационного генеза представляет определенные трудности. Результат - авторами проведено когортное клиническое исследование (182 обследованных) специфичность аутосенсибилизационного процесса лейкоцитов периферической крови к антигенам хрусталика. Продолжительность пребывания в зоне воздействия малых доз ионизирующего излучения составила 5-30 суток. Группу сравнения - 60 пациентов, идентичного пола и возраста, с катарактой, не имевших контакт с ионизирующим излучением в анамнезе. Изучены факторы риска развития катаракты в каждой из вышеуказанных групп. Время наблюдения основной и контрольной групп составило около 10 лет. Контрольную группу составили 60 пациентов, мужского пола, в возрасте от 45 до 58 лет, без патологии хрусталика. В анамнезе отсутствовала связь с ионизирующим излучением. Диагностическое исследование хрусталика пациентов проводилось при медикаментозноммидриазе, биомикроскопическим методом, с помощью прямого фокального освещения щелевой лампой с узким углом микроскопа (10-20 градусов) и максимально узкой осветительной щелью. Материал оценивался в реакции стимулированной лейкергии с хрусталиковым антигеном. Для оценки влияния радиационного фактора в развитии изменений иммунологических показателей у исследованной категории лиц, представлялось необходимым исключить влияние соматической патологии на изучаемые характеристики лейкоцитарной формулы. В связи с этим, была основная группа - 62 пациента, мужского пола,подвергшихся влиянию малых доз ионизирующего излучения, в возрасте от 40 до 60 лет, с начальной и незрелой стадией заднекапсулярнной катаракты на момент обследования. В зависимости от временного ценза, внешнего радиационного фона и полученной средней лучевой нагрузке пациенты были разделены на 3 подруппы 1 - 1986 год - 32 человек, средний возраст на момент облучения составил 34 года полученная доза излучения 18,20,6 сГр., 2 - 1987 год.- 18 человек, средний возраст 37-45 лет полученная доза излучения 8,40,6 сГр и 3 -1988 - 1989 годы, средний возраст на момент облучения 40-52 лет, полученная доза излучения - 12 человек - 3,30,3 сГр. При изучении лейкергии в условиях стимуляции экстрактом хрусталика было установлено, что референтный индекс агломерация лейкоцитов в периферической крови практически здоровых людей, составляет - 1,00,2. У пациентов с катарактой нерадиационного генеза отмечено увеличение индекса агломерации лейкоцитов до 3,20,3, что превышало контрольные величины на 68. Аналогичная динамика наблюдалась при исследовании во времени,когда степень интенсивности агломерации лимфоцитов при катаракте составила 3,30,2, превышая уровень контроля на 64. В тоже время, у пациентов с катарактой,подвергшихся ионизирующему излучения при дозе 18,20,58 сГр (1 подгруппа) наблюдались максимальные значения уровня агломерации лейкоцитов -5,80,7. Исследования проведенные в 2012-2013 г.г. показали дальнейший рост данного индекса до 8,20,7, что превышало как результаты контроля на 87, так и значения 1 подгруппы на 63. Во 2 подгруппе, где доза ионизирующего излучения составила 8,430,60 сГр,чувствительность лейкоцитов периферической крови к радиомодифицирующему агенту - антигену хрусталика превышала установленные референтные величины на 79, а количество агломератов составило 4,60,5. Спустя 10 лет после проведенного исследования динамика степени интенсивности агломерации лейкоцитов оставалась на прежнем уровне - 4,50,5. Аналогичная динамика наблюдалась у пациентов,подвергшихся ионизирующему излучению в дозе 3,270,31 сГр, когда в условиях стимуляции лейкоцитов антигеном хрусталика,результаты агломерции в 2013 году оставались на одном уровне с показателями 2006 года и составили 4,0 0,5 и 4,0 0,4 соответственно. Выводы При стимуляции лейкоцитов экстрактом хрусталика у лиц контрольной группы,индекс 1,030,2 является референтным. Феномен стимулированной лейкергии проявляется у лиц,подвергшихся воздействию ионизирующего излучения в дозе 18,20,58 сГр., и составляет от 5,7 до 8,05 (р 0.001), что говорит о сохраняющейся высокой аутоагрессии к антигенам хрусталика и напряженности клеточного иммунитета. Предлагаемый метод лейкергии в присутствии хрусталикового антигенаявляется достаточно информативным и ресурсно целесообразным для расширения возможностей дифференциальной диагностики катаракты радиационного генеза. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ определения специфичности реакции стимулированной лейкергии в присутствии хрусталикового антигена при прогнозировании катаракты радиационного генеза у лиц подвергшихся влиянию малых доз ионизирующего излучения, отличающийся тем,что к цитратной крови пациента, добавляют хрусталиковый антиген в соотношении 101 в одной пробе и без хрусталикового антигена в другой, в каждой пробе крови под микроскопом подсчитывают 1000 лейкоцитов, отмечая склеенные в группы по 3 лейкоцитов и более, далее высчитывают процент лейкоцитов, склеенных в группы, а разница полученных величин из проб с антигеном и без него (индекс лейкергии) указывает на стимуляцию агломерации хрусталиковыми антигенами и при индексе лейкергии 4,00,5 до 100 определяют катаракту радиационного генеза.