Способ ранней диагностики мультирезистентного туберкулеза костей и суставов

(51) 01 33/53 (2006.01) 01 33/569 (2006.01) 12 15/10 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Способ диагностики туберкулеза костей и суставов включает исследование крови пациента с определением титра противотуберкулезных антител путем иммуноферментного анализа, при этом дополнительно методом(, ) исследуют прямой материал гной, взятый пункционно из места предполагаемого туберкулезного поражения, при значениях ПТА превышающих средние значения у здоровых лиц(М 0,1640,01) на 0,250 и более единиц оптической плотности,выявлении ДНК микобактерий туберкулеза и мутаций в одном или комбинации генов А,детерминирующих МЛУ ТБ, диагностируют мультирезистентный туберкулез костей и суставов. Предлагаемый способ позволяет осуществить раннюю диагностику КСТ с одновременным определением лекарственной устойчивости (МБТ), а также значительно повышает эффективность диагностики, сокращая время, затрачиваемое на верификацию диагноза, с 25-30 до 2 дней. Способ дает возможность уже в первые дни после поступления больного начать этиотропную терапию с учетом чувствительности МБТ к противотуберкулезным препаратам.(72) Аленова Арике Хамзовна Абилдаев Тлеухан Шилдебаевич Игликова Шолпан Кенбаевна Бсмлда Венера Лазарькызы Альходжаев Саруарбек Султанбекович Туткышбаев Серик Оспанович(73) Республиканске государственное казенное предприятие Национальный центр проблем туберкулеза Министерства здравоохранения Республики Казахстан(54) СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ МУЛЬТИРЕЗИСТЕНТНОГО ТУБЕРКУЛЕЗА КОСТЕЙ И СУСТАВОВ(57) Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано для диагностики мультирезистентного туберкулеза костей и суставов. Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано для диагностики мультирезистентного туберкулеза костей и суставов. Мультирезистентный туберкулез вызывается микобактериями, обладающими множественной лекарственной устойчивостью к противотуберкулезным препаратам (МЛУ ТБ) и представляет собой одну из сложнейших проблем фтизиатрии в связи с эпидемиологической опасностью и сложностью его лечения. Лечение МЛУ ТБ требует назначения резервных препаратов с учетом чувствительности к ним микобактерий туберкулеза (МБТ). Проблема усугубляется тем, что больные костносуставным туберкулезом (КСТ), не выделяют мокроту,и микобактерии туберкулеза культуральным способом определяются у них в малом проценте случаев - около 6. При этом такие больные поступают в медучреждения с запущенными формами туберкулеза, с параличами и парезами, так как у них зачастую отсутствуют патогномоничные признаки заболевания. Не редко диагноз ставится только после операции, когда появляется возможность провести гистологическое исследование. Но и оно не всегда отражает истинную картину, так как в силу подавления иммунитета, длительного лечения, отсутствуют в стеклопрепарате характерные для специфического туберкулезного процесса клетки Пирогова Лангханса. Поэтому разработка быстрых и специфичных способов диагностики костно-суставного мультирезистентного туберкулеза является архиактуальной особенно в контексте роста внелегочных форм туберкулеза. Известен способ диагностики туберкулеза костей и суставов, включающий рентгенографическое исследование.(Ракишев Г.Б., Аленова А.Х., Дюсембаев К.А. и др. Современные методы диагностики и лечения костно-суставного туберкулеза. Метод. Рекомендации. - Алматы.-2002. .14) Однако разнообразие клинической картины не всегда позволяет своевременно распознать КСТ. Кроме того при синовиальных формах туберкулеза на рентгенограммах деструкция костной ткани появляется лишь через 1,5-2 года после начала заболевания. Известен способ диагностики туберкулеза костей и суставов,включающий компьютернотомографическое исследование (КТ).(Ракишев Г.Б., Аленова А.Х., Дюсембаев К.А. и др. Современные методы диагностики и лечения костно-суставного туберкулеза. Метод. Рекомендации. - Алматы .-2002. .15) КТ является более информативным исследованием и дает возможность обнаружить мелкие очаги деструкции, однако и в данном случае,патология выявляется тогда, когда деструкция тканей уже наступила. Кроме того дорогостоящая аппаратура не всегда имеется в наличии, особенно в областных и районных туб. диспансерах. 2 Наиболее близким к заявляемому является способ диагностики туберкулеза костей и суставов,включающий исследование крови пациента с определением титра противотуберкулезных антител(ПТА) путем иммуноферментного анализа (ИФА).(Асемгалиев Д., Аленова А.Х., Аманжолова Л.Т. Клинико-иммунологические показатели у больных костно-суставным туберкулезом. // ЦентральноАзиатский медицинский журнал, 2003, Т 9,приложение 2, с.73-74.) Однако данный способ не позволяет определять наличие лекарственной устойчивости (МБТ), и,своевременно назначить соответствующее лечение резервными препаратами. Задача изобретения - разработка способа ранней диагностики мультирезистентного туберкулеза костей и суставов. Технический результат - предлагаемый способ позволяет осуществить раннюю диагностику КСТ с одновременным определением лекарственной устойчивости (МБТ), а также значительно повышает эффективность диагностики, сокращая время,затрачиваемое на верификацию диагноза с 25-30 до 2 дней. Способ дает возможность уже в первые дни после поступления больного начать этиотропную терапию с учетом чувствительности МБТ к противотуберкулезным препаратам. Указанный технический результат достигается тем, что в способе диагностики туберкулеза костей и суставов, включающем исследование крови пациента с определением титра противотуберкулезных антител путем иммуноферментного анализа,отличительной особенностью, согласно изобретению, является то,что дополнительно методом(, ) исследуют прямой материал гной, взятый пункционно из места предполагаемого туберкулезного поражения, при значениях ПТА превышающих средние значения у здоровых лиц(М 0,1640,01) на 0,250 и более единиц оптической плотности,выявлении ДНК микобактерий туберкулеза и мутаций в одном или комбинации генов А,детерминирующих МЛУ ТБ, диагностируют мультирезистентный туберкулез костей и суставов. Способ осуществляется следующим образом. Иммуноферментный анализ проводят следующим образом у больного из локтевой вены утром натощак забирают 3 мл крови в центрифужную пробирку без гепарина. Определение противотуберкулезных антител проводят с тест-системой АТ-Туб-Бест-стрип Новосибирского ЗАО Вектор-Бест (предназначен для определения суммарного пула антителА, М, к возбудителю туберкулеза). Реакцию проводят строго в соответствии с прилагаемыми инструкциями на иммуноферментном анализаторе. Методика проведения ИФА тест-системой АТТуб-Бест-стрип следующая метод двух стадийный. Антигены микобактерий туберкулеза А 60 сорбированы на твердую фазу плашечного формата. После внесения испытуемых сывороток поэтапно добавляют пероксидазный конъюгат-, а затем субстратный раствор с ТМБ-красителем. Результат учитывается фотометрически по способности красителя поглощать световой пучок и оценивается относительно отрицательного контроля тест-систем. Учет результатов в плашечном формате ведут на иммуноферментном анализаторе(Италия) по величине оптического поглощения красителем светового пучка с длиной волны 450 нм.( , ) осуществляют в 3 этапа на первом этапе осуществляют выделение ДНК. Для чего 500 мл деконтаминированного гноя центрифугируют 15 мин при 10000 в центрифуге с аэрозольнепроницаемым ротором,удаляют супернатант,добавляют 100 мкл воды,ресуспензируют смесь с помощью вортекса,инактивируют при температуре 95 С 20 минут в водяной бане и инкубируют в ультразвуковой ванне 15 минут. После чего центрифугируют при 13000 5 минут и переносят супернатант, содержащий ДНК,в новую пробирку. На втором этапе вначале приготавливают амплификационную смесь 35 мл , 5 мкл 10 буфер (содержит 15 2), 2 мкл 2(25 2) 3 мклН 2,0,2 мкл ( 1 часть). Переносят по 45 мкл смеси в ПЦР-пробирки, добавляют по 5 мкл выделенной ДНК и помещают их в ПЦР-машину с применением специальной программы(40). На третьем этапе используют программу 1 для гибридизации, для чего 20 мклсоединяют с 20 мкл амплификационной смеси и инкубируют 5 мин при комнатной температуре. Добавляют 1 мл. предварительно подогретогои аккуратно смешивают, затем кладутв лунки лотка. Инкубируют 30 мин при 45 С, затем удаляют полностью . Добавляют 1 мли инкубируют 15 мин при 45 С. Удаляют полностью. Добавляют 1 мл . Инкубируют 1 минуту при комнатной температуре. Удаляют полностью-1 мл разведенного конъюгата) разведенного конъюгата и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Удаляют полностью конъюгат. Добавляют 1 мл . Инкубируют 1 минуту при комнатной температуре. Удаляют полностью . Процедуру проводят дважды. Далее добавляют 1 мл дистиллированной воды и промывают один раз водой в течении 1 мин. Добавляют 1 мл (10 мкл -990 мкл -1 мл разведенного субстрата) разведенного субстрата и инкубируют 2-10 мин. при комнатной температуре. Удаляют полностью субстрат. Останавливают реакцию промыванием дважды водой в течение 1 мин. Переносятиз лотка и высушивают его на адсорбирующей бумаге,считывают результат. При значениях ПТА превышающих средние значения у здоровых лиц (М 0,1640,01) на 0,250 и более единиц оптической плотности,выявлении ДНК микобактерий туберкулеза и мутаций в одном или комбинации генов , , А, детерминирующих МЛУ ТБ, диагностируют мультирезистентный туберкулез костей и суставов. В отличии от существующих классических методов диагностики МЛУ ТБ, позволяющих выявить его только через 2 и более месяцев,предлагаемый нами экспресс способ диагностики мультирезистетного туберкулеза(МЛУТБ) позволяет выявить мутации, ответственные за резистентность к изониазиду и рифампицину, в течении 2 дней и, соответственно, сразу изолировать больных и назначить адекватную терапию. Он активно внедряется в Казахстане и позволяет быстро и точно выявить ДНК микобактерий туберкулеза и установить ряд генов (, , А),детерминирующих МЛУ ТБ. Нами впервые предложен и апробирован способ диагностики мультирезистентного туберкулеза костей и суставов с использованием прямого патологического материала - гноя из места поражения. Для решения поставленной задачи нами осуществлено исследование по предлагаемому способу прямого материала - гноя, взятого пункционно из места предполагаемого туберкулезного поражения. Параллельно с проведением Хайн теста исследовали уровень противотуберкулезных антител в периферической крови. Контролем молекулярно-генетического метода служил культуральный метод определения туберкулеза и МЛУТБ на жидких средах (золотой стандарт - Бактек 960). Всего для этой цели обследовано 25 больных с подозрением на туберкулезный спондилит (15 чел.),милиарный туберкулез (1 чел.), туберкулезный лимфаденит (9 чел.). Результаты исследования показали, что у всех больных имеет место туберкулез согласно данным( , ), так как во всех случаях имелись четкие положительные полоски. У части этих больных клинически был заподозрен мультирезистентный туберкулез. При дальнейшем диагностическом исследовании выяснилось, что у 17 больных была сохранена чувствительность к рифампицинуи изониазиду(Н), а у 8-ми - выявлен мультирезистентный туберкулез,так как были определены соответствующие мутации на рифампицин в гене 3 531 и на изониазид в гене 1 3151. Важно отметить, что средний уровень противотуберкулезных антител у этих больных по данным иммуноферментного анализа составил 0,4980,05 ед.о.пл, в то время как в контроле у здоровых лиц он был равен 0,1640,03 ед.о.пл. Результаты( ,) и ИФА были получены уже на второй день после взятия материала и свидетельствовали о наличии туберкулеза у всех больных, в том числе мультирезистентного процесса - у 8 обследованных. Через 18-25 дней были получены данные культурального исследования патологического материала, включая данные теста на лекарственную чувствительность (ТЛЧ), совпавшие в 100 случаев,и подтвердившие туберкулезный процесс у всех 25 больных с внелегочным туберкулезом и 3 мультирезистетную форму заболевания у 8 из обследованных пациентов. Вышеизложенное позволяет использовать предлагаемый способ для выявления МЛУТБ у больных с внелегочной формой туберкулезного процесса путем одновременного тестирования патологического материала(гноя,пунктата) методом( ,) и исследования периферической крови методом ИФА. Своевременная экспресс диагностика тяжелейшей формы - мультирезистенного туберкулеза позволяет начать этиотропное лечение уже на 2-ой день после получения результата, против 20 - 25 дней при диагностике другими способами (золотой стандарт Бактек 960). Приводим клинический пример использования предлагаемого способа. Больной Д., 06.07.1981 г.р., обратился в Национальный центр проблем туберкулеза 22.02.12. с жалобами на боли в поясничном отделе позвоночника и коленном суставе слева,невозможность сгибания в суставе, слабость. Анамнез заболевания Ранее туберкулезом не болел, туб. контакт не известен. Считает себя больным с 2006 г, когда появились боли в пояснице и коленном суставе слева. Лечился в течение 2 лет с диагнозом Ревматоидный артрит коленного сустава слева. В области коленного сустава слева появился функционирующий свищ с гнойным отделяемым. В январе 2012 г боли в пояснице усилились, больной перестал ходить. Консультирован у нейрохирурга,рекомендована МРТ позвоночника. 08.02.12 г произведена МРТ позвоночника, заподозрен туберкулезный процесс и больной направлен вНЦПТ РК Анамнез жизни Болезнь Боткина, кожновенерические и онкологические заболевания отрицает. Аллергии к медикаментам не отмечает. Последние 6-месяцев гемотрансфузии не проводились. Общее состояние средней тяжести, за счет болевого синдрома. Сознание ясное, адекватен. Кожные покровы и видимые слизистые обычной окраски. В легких дыхание везикулярное, хрипы не выслушиваются. Сердечные тоны ясные, ритм правильный АД-120/80 мм.рт.ст. -78 уд/мин. Язык влажный, чистый. Живот не вздут, мягкий,безболезненный, перистальтика прослушивается. Печень и селезенка не увеличены. Симптом поколачивания отрицателен с обеих сторон. Стул и мочеиспускание не нарушены. Статус локалис Положение вынужденное,нуждается в постороннем уходе. В проекции 2-3 гиббус. Левая нижняя конечность атрофирована,имеется укорочение на 2,0 см, отмечается анкилоз в коленном суставе. Обследован 22.02.12 г. грамма органов грудной клетки без очаговой патологии.от 24.03.12 эритроциты - 3,71012,гемоглобин - 108 г/л, лейкоциты - 5,3109,эозинофилы - 2, сегментядерные - 56109,лимфоциты ОАМ 23.02.12 г. удельный вес - 1,025, белок в, реакция кислая, прозрачность полная, цвет с/ж,плоский эпителий 0-2, лейкоциты 1-4 в поле зрения. Биохимический анализ крови от 24.02.12 г. билирубин - 12,8, АлаТ -22,8, тимоловая проба 0,94, сахар - 5,1, общий белок - 64, мочевина - 2.3 ЭКГ Синусовый ритм ЧСС 76 уд. в минуту. Нормальное положение ЭОС. Диагностика проведена по предлагаемому способу для верификации диагноза и выявления наличия резистентности(МЛУТБ),взят патологический материал из псоасабсцесса на молекулярно-генетическое обследование (, ) и периферическая кровь для определения уровня противотуберкулезных антител в крови методом ИФА. Параллельно взят материал на бактериологическое исследование (Бактек 960). Через 2 дня 24.02.12 были получены данные молекулярно генетического исследования патологического материала методом,свидетельствующие об устойчивой форме туберкулеза, так были выявлены мутации в генах 3 531 и в гене 1 3151. По данным иммуноферментного анализа установлен повышенный титр противотуберкулезных антител в крови - 0,450 ед.о.пл. На ВКК от 24.02.12 г. на основании полученных данных молекулярно-генетического и иммунологического исследования было решено начать лечение по схемекатегории- 0.75 43,- 0.75 43,- 0.75 43,- 0.75 43, - 0.75 86, дополнительно назначен глицин по 1 таб.43, омегаст по 1 таб. 2 рхд 8, алмагель по 1 ст.л. 3 р. в день 7, инфузионная терапия натрий хлорид 0,9 - 400 мл 3, глюкоза 5 - 400 мл 3. Данные бактериологического исследования на Бактек 960, полученные через 25 дней подтвердили результаты молекулярногенетического метода и ИФА, посев гноя из свища коленного сустава на микобактерий туберкулеза положительный от 04.04.12 г. ТЛЧ от 16.04.12 г устойчивость к препаратам первого ряда. Больному 20.06.2012 г произведена операция Псоасабсцессотомия,некрэктомия тел 2-3,дренирование. Послеоперационный период протекал гладко, послеоперационная рана зажила вторичным натяжением. Гной на МТ от 31.05.12 г отрицательный 1373. Гистологическое исследование 700-709 от 26.06.12 г Туберкулезный спондилит. Некротический тип воспаления. На фоне проводимой терапии наблюдалась хорошо выраженная положительная клинико-рентгенологическая динамика, в виде улучшения общего состояния, уменьшения боли в позвоночнике, вплоть до полного купирования, на контрольной рентгенографии позвоночника - также положительная динамика. Больной выписан с заключительным диагнозом Туберкулезный спондилит 2-3, ограниченнодеструктивная форма,активная стадия. Туберкулезный гонит слева, активная стадия, 28485 осложненный анкилозом. МЛУ ТБ.категория. Состояние после операции - абсцессотомии,некрэктомии тел 2-3 позвонков. Таким образом, применение предлагаемого способа позволило сократить время верификации диагноза до 2 дней, а ранняя диагностика МЛУ ТБ позволила сразу назначить больному этиотропное лечение резервными препаратами, быстро добиться значительного клинического улучшения,и соответственно снизить срок стационарного лечения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ диагностики туберкулеза костей и суставов,включающий исследование крови пациента с определением титра противотуберкулезных антител путем ИФА,отличающийся тем, что дополнительно методомисследуют гной, взятый пункционно непосредственно из места предполагаемого туберкулезного поражения, и, при значениях ПТА,превышающих средние значения у здоровых лиц(Мт 0,1640,01) на 0,250 и более единиц оптической плотности,выявлении ДНК микобактерий туберкулеза и мутаций в одном или комбинации генов детерминирующих множественную лекарственную устойчивость к противотуберкулезным препаратам,диагностируют мультирезистентный туберкулез костей и суставов.