Способ получения антигена для серологической диагностики трипаносомоза животных

(51) 61 39/005 (2006.01) 61 10/00 (2006.01) 12 1/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Способ получения антигена для серологической диагностики трипаносомоза животных, вызываемый видомР-0201, которым заражают белых крыс, затем берут кровь, после чего отделение трипаносомы от форменных элементов крови и осуществляют отстаивание, затем разрушают полученные клетки культуры трипаносом двухкратным воздействием ультразвука при частоте 22 кГц и мощностью 100 Вт/см 2 с интервалом 30 мин, после чего полученную суспензию центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин, осадок удаляют, а к надосадочной жидкости добавляют 96 раствор охлажденного этилового спирта в соотношении 13 соответственно, тщательно перемешивают и выдерживают в течение 10 час при температуре 5 С,полученный осадок вновь центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин, надосадочную жидкость отбрасывают,осадок растворяют в физиологическом растворе рН до 8,5 и доводят концентрацию белка до 1 мг/см 3 и рН до 7,2-7,5.(72) Шалабаев Болат Абуович Кадыров Серикбай Оразбаевич Сулейменов Маратбек Жаксыбекович(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(56) Предварительный патент РК 10889, 61 39/005, 61 10/00, 2001 г(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ТРИПАНОСОМОЗА ЖИВОТНЫХ(57) Изобретение относится к области ветеринарной иммунологии и может быть использовано при изготовления антигенов,применяемых для серологической диагностики трипаносомозов животных. Технический результат,обеспечиваемый изобретением выражается в получении высокоактивного и стабильного антигена для постановки серологической реакции при диагностике трипаносомоза животных. Изобретение относится к области ветеринарной иммунологии и может быть использовано при изготовления антигена,применяемого для серологической диагностики трипаносомоза животных. Известен способ получения антигена для серологической диагностики трипатюсомозов животных,вызываемых видом, включающий заражение возбудителем трипаносомоза белых крыс, взятие крови,центрифугирование и отделение осадка от надосадочной жидкости, Патент Республика Казахстан 10889, А 61 39/005, 61 В 10/00, 2001. Недостатком указанного способа получения антигена является присутствие в целевом продукте значительного количества балластных компонентов,таких, как форменные элементы крови, что снижает реакционную способность антигена и обусловливает его невысокую специфическую активность. Задачей изобретения является разработка способа получения антигена для серологической диагностики трипаносомоза животных,вызываемых,обеспечивающего получение высокочувствительного,высокоспецифичного,очищенного от балластных компонентов антигена. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении высокоактивного и стабильного антигена для постановки серологической реакции при диагностике трипаносомоза животных. Способ получения антигена для серологической диагностики трипаносомоза животных, вызываемый видомР-0201, которым заражают белых крыс, затем берут кровь, после чего отделение трипаносомы от форменных элементов крови и осуществляют отстаивание, затем разрушают полученные клетки культуры трипаносом двухкратным воздействием ультразвука при частоте 22 кГц и мощностью 100 Вт/см 2 с интервалом 30 мин, после чего полученную суспензию центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин, осадок удаляют, а к надосадочной жидкости добавляют 96 раствор охлажденного этилового спирта в соотношении 13 соответственно, тщательно перемешивают и выдерживают в течение 10 час при температуре 5 С,полученный осадок вновь центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин, надосадочную жидкость отбрасывают,осадок растворяют в физиологическом растворе рН до 8,5 и доводят концентрацию белка до 1 мг/см 3 и рН до 7,2-7,5. В изобретении используется штамм(коллекционный номер КазНИВИ БШ 68) депонированный в Лаборатории генофонда микроорганизмов ТОО Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт. Штамм характеризуется следующими признками,которыми обладаетР-0201. Морфологические признаки. Штамм возбудителя трипанозомоза животных. Окраска по Грамму отрицательная. Культуральные свойства. Р-0201 имеет тело веретенообразной формы, концы его сужены, передний более застроен. Вдоль тела трипаносомы продолжается жгутик, соединяющийся с ним ундулирующей мембраной. Мембраны ядерной оболочки имеют характерную трехслойную структуру,гликопротеины с молекулярной массой 65000. Размеры тела 15-321,4-2,8 мк, размеры жгутика 5,53 до 6,67, цвет серый. Обладает активным поступательным движением. При рН менее 5,5,трипаносома неустойчива, деление клеток бесполое продольное. Специализированные клетки не образует, при максимальной паразитемии количество их доходит от 800 тыс. до 1 млн. трипаносом в 1,0 мл. Биохимические свойства. ШтаммР-0201, штамм типовой вирулентный,адаптированный на лабораторных животных,предназначен для приготовления диагностических препаратов. Култивирование(на белых мышах) позволяет сохранить высокую вирулентность штамма,что обеспечивает максимальную паразитарную реакцию (до 500 и выше трипаносом в поле зрения микроскопа). Штамм не культивируется на питательных средах,культурах клеток и эмбрионах. Для трипаносомы характерны паразитизм,аэробное дыхание и осмотическое питание(сапрофитное). Антигенные свойства. Отличительной особенностью является наличие большого числа(более 100) различных поверхностных антигенов и основных антигенных типов,наличие типоспецифических экзоантигенов. Титры антител в РСК И РДСК составляют 130, 140. Маркерные признаки. Вариабельность антигенной структуры. Штамм трипаносом имеет 8 мажорных полипептидов с молекулярной массой 36,44, 47, 50, 64, 86, 92 кДа, из которых суперможорные с м.м. 44, 54 и 71 кДа. Патогенные свойства. ШтаммР-0201 КазНИВИ патогенен для лошадей, ослов, мулов, лошаков, собак, а также для лабораторных животных белых мышей, крыс,морских свинок, кроликов. Иммуногенность. Нет. Реактогенность. ШтаммР-0201 слабореактогенен для лошадей при внутримышечном введении. Спорообразование. Специализированные клетки не образуются. Реверсабельность и реактогенность. Штамм не отличается от эпизоотических изолятов, обладает высокой активностью при подкожном введении. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства, в том числе патогенные и вирулентные, штаммаР-0201 стабильно сохраняются. Способ получения антигена состоит в следующем. Пример 1. Способ получения антигена для серологической диагностики трипаносомоза животных,вызываемый видом Р-0201, которым заражают белых крыс,затем берут кровь, после чего отделение трипаносомы от форменных элементов крови и осуществляют отстаивание, затем разрушают полученные клетки культуры трипаносом двухкратным воздействием ультразвука при частоте 22 кГц и мощностью 100 Вт/см 2 с интервалом 30 мин, после чего полученную суспензию центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин,осадок удаляют, а к надосадочной жидкости добавляют 96 раствор охлажденного этилового спирта в соотношении 13 соответственно,тщательно перемешивают и выдерживают в течение 10 час при температуре 5 С, полученный осадок вновь центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин, надосадочную жидкость отбрасывают,осадок растворяют в физиологическом растворе рН до 8,5 и доводят концентрацию белка до 1 мг/см 3 и рН до 7,2-7,5. Пример 2. При титровании комплемента морской свинкой в реакции связывания комплемента (РСК) и приготовленного антигена в рабочем титре полученные одинаковые титры комплемента, что свидетельствует об отсутствии антикомплементарного свойства приготовленного антигена. Активность полученного описанным способам антигена была проверена в лабораторных условиях при постановке РСК/РДСК с сыворотками крови от здоровых и больных лошадей. Результаты оценки активности предлагаемого антигена для РСК (РДСК) при трипаносомозе животных приведены в таблице 1 и 2. Из таблицы 1 видно, что антиген, полученный описанным способам,с серопозитивными сыворотками в разведениях 15 и 110 дает положительные результаты при разведении антигена 1200,с серонегативными дает отрицательные результаты, что доказывает его достаточно высокую активность и специфичность. Это позволит использовать его в качестве антигена для в РСК (РДСК), обладающего высокой чувствительностью в выявлении трипаносомоза животных. Из таблицы 2 видно, что антиген, полученный описанным способам,с серопозитивными сыворотками в разведениях 15 и 110 дает положительные результаты при разведении антигена 1200,с серонегативными дает отрицательные результаты, что доказывает его достаточно высокую активность и специфичность. Это позволит использовать его в качестве антигена для в РСК (РДСК), обладающего высокой чувствительностью в выявлении су-ауру верблюдов. Готовый антиген расфасовывают в стерильные ампулы по 1 мл подвергают сублимационной сушке. Антиген может храниться до 6 мес. при температуре 4 С и в лиофилизированном виде 2-3 года, не теряя своего исходного титра. Перед использованием его необходимо титровать с положительными и отрицательными сыворотками. Предложенный способ получения антигена для серологической диагностики трипаносомоза животных и су-ауру верблюдов обеспечивает высокую активность и специфичность антигена, что позволяет повысить достоверность серологических реакций. Таблица 1 Оценка активности предлагаемого антигена для РСК (РДСК) при су-ауру верблюдов Наименование Положительной Отрицательной Контроль (физ.раствор) Оценка активности предлагаемого антигена для РСК (РДСК) при случной болезней лошадей Наименование Положительной Отрицательной Контроль (физ.раствор) ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения антигена для серологической диагностики трипаносомоза животных, вызываемых видом, включающий заражение возбудителем трипаносомоза белых крыс, взятие крови, центрифугирование и отделение осадка от надосадочной жидкости, отличающийся тем, что в качестве материала для антигена используют штаммР-0201,которым заражают белых крыс, затем берут кровь,после чего проводят отделение трипаносомы от форменных элементов крови и осуществляют отстаивание, затем разрушают полученные клетки культуры трипаносом двухкратным воздействием ультразвука при частоте 22 кГц и мощностью 100 Вт/см 2 с интервалом 30 мин, после чего полученную суспензию центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин, осадок удаляют, а к надосадочной жидкости добавляют 96 раствор охлажденного этилового спирта в соотношении 13 соответственно, тщательно перемешивают и выдерживают в течение 10 часов при температуре 5 С, полученный осадок вновь центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин, надосадочную жидкость отбрасывают, осадок растворяют в физиологическом растворе рН до 8,5 и доводят концентрацию белка до 1 мг/см 3 и рН до 7,2-7,5.