Штамм бактерий ESCHERICHIA COLI 64Г, используемый для изготовления препарата для лечения и профилактики заболеваний новорожденных животных и птиц

(51) 61 39/108 (2006.01) 12 1/20 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ быть использовано для лечения и профилактики заболеваний новорожденных животных. Целью изобретения является получение штамма Е .64 Г обладающий адгезивной способностью,высокой приживаемостью, длительным сроком элиминации,высокой антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, наличием генетической метки, позволяющий отличать его от естественных прототипов и подтверждающий его безопасность, который может быть использован для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний новорожденного молодняка животных и птиц.(72) Бияшев Кадыр Бияшевич Бияшев Биржан Кадырович Киркимбаева Жумагуль Слямбековна Ермагамбетова Светлана Емелсовна Макбуз Аманжол Жасбилим(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ 64 Г, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ НОВОРОЖДЕННЫХ ЖИВОТНЫХ И ПТИЦ Изобретение относится к биотехнологии, в частности к ветеринарной микробиологии, и может быть использовано для лечения и профилактики заболеваний новорожденных животных и птиц. Известен штаммВ 379 М,используемый для изготовления пробиотического препарата, предназначенный для медицинской практики и применяемый в ветеринарии ( Сборник научных трудов МНИИЭМ.- М.1986). Пробиотические препараты на основе микроорганизмов родов бифидобактерии и лактобактерии являются видоспецифичными для того обьекта, от кого они выделены. Известно, что род бифидобактерии обьединяет 24 вида, род лактобактерии еще больше. Одни виды обитают только у животных определенных видов, другие - у животных многих видов, третьи - у животных и человека, четвертые - только у человека. Соответственно способность заселять кишечник у человека, животных или птиц различна. Препараты,включающие лакто- и бифидобактерии. могут быть неэффективны если производятся на основе медицинских или фармокологически неактивных в кишечнике животных и птицы штаммов микроорганизмов. Бактерии, составляющие основу препарата,должны отвечать следующим требованиям, предьявляемым к пробиотикам- являтся нормальными обитателями желудочнокишечного тракта здоровых животных, быть непатогенными, нетоксичными- быть метаболически активными в экосистеме желудочно-кишечного тракта- переносить пассаж через желудок- обладать способностью к адгезии на эпителии и приживанию в пищеварительном трактке, где ферментативная активность,связанная с перевариванием корма высокая, а среда агрессивная- быть стабильными и способными длительное время оставаться жизнеспособными при хранении в производственных условиях. Известен производственный штамм 64, полученный путем направленной селекцией выделенной культуры от здоровых ягнят(Инновационный патент 23876. зарегистрированный в Государственном реестре изобретений Республики Казахстан 23.02.2011 г.). Штамм Е.64 почти полностью соответствует вышеописанным требованиям к штаммам продуцентам. Недостатком штамма Е.64 является то. что отсутствует генетические метки,позволяющие отличать его от естественных прототипов. Задачей изобретения является штамм 64 Г обладающий адгезивной способностью,продуцирующий микроцины. высокой антагонистической активностью по отношению к патогенным микроорганизмам,стабильностью аттенуации, маркировенный и безопасного для изготовления эффективного ветеринарного пробиотического препарата против желудочнокишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных и птиц. Штамм 64 Г получен в результате селекции исходного производственного штамма 64. Исходный штамм 64 высеивают на чашки с агаром Хоттингера в концентрации 109 микробных клеток. Чашки с агаром содержат 50 мкг/мл неамина и 50 мкг/мл рифампицина. Полученные мутанты с желаемым фенотипом 3 раза рассеивают на селективной среде с антибиотиками. Вирулентность выделенных клонов изучают в опытах на мышах при их внутрибрюшинном заражении. Мутанты с фенотипом 100 и 100 характеризуются снижением вирулентности на 5-6 порядков в отличие от мутантов, устойчивых к неамину и рифампицину (фенотип 200 и 200). Отбирают аттенуированный клон 64 Г (501010 бактерий), который является донорским штаммом в опытах трансдукции с использованием бактериофага Р 22. Показано, что передача каждой из мутаций, обуславливающих фенотип мутанта 64 Г, в исходный производственный штамм . 64 приводит к снижению его вирулентности. Среди трансдуктантов,приобретших одновременно мутации, сообщающие резистентность к неамину и рифампицину отобран штамм 64 Г. Штамм 64 Г депонирован в ГУ Национальный центр мониторинга, референции,лабораторной диагностики и методологии в ветеринарии КГИ в АПК МСХ РК. лаборатория Национальная коллекция депонированных штаммов микроорганизмов за 03-65. Штамм Е .64 Г характеризуется следующими признаками и свойствами. Морфологические признаки Клетки штамма короткие палочки (1.1-1,6)(2,05.9) мкм, подвижные, грамотрицательные, спор и капсул не образуют. Культуральные свойства. Бактерии штамма при росте на мясопептонном агаре через 24 ч образуют гладкие, выпуклые,круглые, блестящие, полупрозрачные колонии серого цвета с ровным краем, на среде Эндо через 24 ч - круглые колонии темно-красного цвета с металлическим блеском. При культивировании в жидких средах - бактерии штамма через 18 ч образуют равномерное помутнение. Физиолого-биохимические признаки Диапазон температур роста 37-39 С. оптимальная температура 37 С. Оптимум рН 6.8-7.5. В качестве источника углерода используют глюкозу,лактозу, мальтозу, арабинозу. маннит. сорбит,сахарозу, дульцит, салицин. Образует индол и не образует сероводород. Обладает лизин - и орнитиндекарбоксилазной активностью, не обладает уреазной активностью. Не разжижает желатин. Антигенная структура Типичная для Е .0-группа 111, с адгезинами 41 и К 99 . Резистентность к антибиотикам. Устойчив к 100 мкг/мл неамина и 100 мкг/мл рифампицина. Стабильность аттенуации и маркеров резистентности к антибиотикам у штамма 64 Г определяют путем обработки штамма мутагеном нитрозогуанидином. Изучение указанных свойств у 10 клонов штамма, отобранных после такой обработки, выявило их сохранение на том же уровне, что и у необработанной культуры (509,0 0,20), минимальная подавляющая концентрация неамина 50 мкг/мл рифампицина 50 мкг/ мл). Генетический анализ безопасности штамма 64 Г. как штамма продуцента препарата пробиотика. Генетическое изучение штамма . 64 Г проведенное с использованием трансдуцирующего бактериофага Р 22. показало, что его фенотип определяется наличием 2 независимых мутаций - вгене и в гене, детерминирующем резистентность к неамину. Изучение вирулентности полученных трансдуктантов при внутрибрюшинном заражении белых мышей выявило снижение ее клонов, которые приобрели как 2 мутации,сообщающие резистентность к неамину и рифампицину, так и каждую в отдельности. Присутствие в штамме 64 Г двух мутаций, каждая из которых может снижать вирулентные свойства,служит убедительным доказательством стабильности и безопасности штамма-продуцента Е.64 Г. Дифференциация штамма-продуцента Е.64 Г от культур естественного происхождения. Штамм Е.64 Г дифференцируется от культур естественного происхождения по резистентности к 2 антибиотикам - неамину (100 мкг/мл) и рифампицину (100 мкг/мл). Патогенные свойства Тест культуры Культура . 64 Г не вызывает заболевания и гибели белых мышей при внутрибрюшинном и пероральном введении 24-часовой культуры штамма 64 Г в дозах 105, 107, 109 и 1010 КОЕ (509,0 0,10, методу Рида и Менча с величиной средней ошибки, вычисленной по формуле Пицци). Штамм Е.64 БГ антагонистически активен в отношении следующих тест - культур Е . , .. Пример 1. Изучают антагонистическую активность культуры 64 Г и штамма сравнения В.В 379 М. Культуру 64 Г выращивали на жидкой среде (МПБ) в термостате 16-18 ч при 37-38 С. Культуру В 379 М выращивали на кукурузно-лактозной среде. Затем антагонистическую активность определяли микробиологическим способом - методом диффузии в агар (метод лунок). В чашках Петри, засеянных тест-культурами, сделали лунки. В лунки вносили штаммы 64 Г и В 379 М из расчета 1,0 см 3. Чашки выдерживали в термостате при 37 С в течение 18-24 часа. Измеряли диаметр отсутствия роста тест- культур. Результаты определения антагонистической активности штаммов Е.64 Г и 5 В 379 М приведены в таблице 1. Зона задержки тест культур, в мм Из материала таблицы видно, что штамм 64 подавляет рост всех исследованных тест-культур,причем зоны подавления роста большинства из них больше, чем при штамме В 379 М. Это свидетельствует о более высокой антимикробной активности предлагаемого штамма Е .64 Г. Пример 2. Изучение сроков персистирования предлагаемого и штамма бифидобактерии в кишечнике животных. Длительность пеосистирования бактерий в организме обусловлена способностью штамма прикрепляться к стенке кишечника и размножаться в пристеночном слое или кишечном содержимом. Формируют три группы беспородных белых мышей массой 14-16 г. по 20 голов в каждой группе. На кукурузно - лактозной среде выращивают двухсуточную культуру штамма В 379 М. культуру штамма 64 Г вынашивают на МПА. Высохшие культуры штаммов В 379 М и 64 Г по оптическому стандарту мутности доводят концентрацию по значения 109 КОЕ. Первой группе мышей вводят однократно пеоооально по 0.5 мл культуры штамма Е.64 Г. второй группе - культуру штамма В .В 379 М в том же объеме. Третью группу мышей используют в качестве контрольной, которой вводят в том же объеме Физиологический раствор. По 5 мышей каждой из трех групп убивают через 12 часов. 24 часа, через 2 и 3 суток после введения культур В 379 М и 64 Г. Вскрывают кишечники мышей,отбирают участки тонкого и толстого отделов кишечника и делали посевы на питательные среды. Посевы выдерживают в термостате пои 37 С в течение 24 ч. 3 По окончании культивирования отмечают пробы с наличием колоний, типичных для бифидобактерий и эшерихии. Результаты подтверждают микроскопией мазка, окрашенного по граму. Положительным считается результат при наличии в посевах хотя бы одной колонии исследуемых культур. За 100 берется значение при высеваемости бифидобактерий и эшерихии от 5 мышей в каждом определении. Опыт проводят в трех повторениях. Штамм Е .64 Г обладает большей приживаемостью в кишечнике белых мышей, чем штамм В.В 379 М, что установлено срокам его выделения из кишечника и кишечного содержимого. ПРИМЕР 3. Препарат из штамма Е 64 Г приготавливают путем выращивания в аппарате для культивирования микроорганизмов(АКМШ). Выращивание культуры в аппарате в течение 1618 ч при 37-38 С с аэрацией, после чего производят смыв культуры средой для высушивания,содержащей желатин 1,5-2, сахарозу 10.рН 7,48,0. После проверки полученной микробной массы на чистоту и типичность роста ее доводят до концентрации 10 млрд. КОЕ в 1 мл по стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича. Полученную массу разливают во флаконы объемом 4.0 см 3. подвергают лиофильной сушке до получения сухого продукта пробиотика. Сохраняют препарат при температуре 4-6 С. Срок годности 12 месяцев. Пример 4. Для изучения эффективности препарата из штамма . 64 Г бактериальную взвесь, приготовленную для высушивания, разводят стерильным физиологическим раствором до концентрации 109 КОЕ в 1 мл. Антагонистическую активность штамма . 64 Г изучали на новорожденных телятах, ягнятах, поросятах и цыплятах путем однократной пероральной выпойкой животных в дозах соответственно -30109,5109, 5109, и 109 КОЕ. Спустя 24 часа всем опытным и контрольным животным вводили перорально вирулентную культуру эшерихии в оттитрованной смертельной дозе. Все подопытные животные выжили, при падеже контрольных. Таким образом, штамм Е.64 Г обладающий адгезивной способностью,высокой приживаемостью, длительным сроком элиминации,высокой антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, наличием генетической метки,позволяющий отличать его от естественных прототипов и подтверждающий его безопасность,может быть использован для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний новорожденного молодняка животных и птиц. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм бактерий 64 Г,депонирован в ГУ Национальный центр мониторинга,референции,лабораторной диагностики и методологии в ветеринарии КГИ в А ПК МСХ РК, лаборатория Национальная коллекция депонированных штаммов микроорганизмов, под регистрационным номером 03-65, используемый для изготовления препарата для лечения и профилактики заболеваний новорожденных животных и птиц.