Способ получения антигена для серологической диагностики токсоплазмоза животных

(51) 61 39/002 (2006.01) 61 10/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ паразитарной массы, ее очистку от балластных компонентов, центрифугирование и отделение целевого продукта, в качестве материала для антигена используют штаммР-0175 СКС 1112 КазНИВИ, которым заражают белых мышей, затем берут внутрибрюшинный экссудат, который центрифугируют при 6000 об/мин в течение 15 мин, отделяют осадок от надосадочной жидкости, проводят отделение токсоплазм от форменных элементов внутрибрюшинного экссудата путем отстаивания, затем разрушают полученные клетки культуры токсоплазм трехкратным воздействием ультразвука при частоте 22 кГц и мощностью 100 Вт/ см 2 с интервалом 30 мин, после чего полученную суспензию центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин,осадок удаляют, а к надосадочной жидкости добавляют 96 раствор этилового спирта в соотношении 13 соответственно, тщательно перемешивают и выдерживают в течение 10 час при температуре 5 С, полученный осадок вновь центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин,надосадочную жидкость отбрасывают, осадок растворяют в физиологическом растворе рН до 8,5 и доводят концентрацию белка до 1 мг/см 3 и рН до 7,2-7,5.(72) Шалабаев Болат Абуович Сулейменов Маратбек Жаксыбекович(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ТОКСОПЛАЗМОЗА ЖИВОТНЫХ(57) Изобретение относится к области ветеринарной иммунологии, конкретно - к серологической диагностике и может быть использовано при изготовления антигенов,применяемых для серологической диагностики токсоплазмозов животных. Технический результат,обеспечиваемый изобретением выражается в получении высокоактивного и стабильного антигена для постановки серологической реакции при диагностике токсоплазмозов животных. Способ получения антигена для серологической диагностики токсоплазмоза животных, включающий заражение возбудителем белых мышей, получение Изобретение относится к области ветеринарной иммунологии, а именно к серологической диагностике и может быть использовано при изготовления антигенов,применяемых для серологической диагностики токсоплазмоза животных. Известен способ получения антигена для серологической диагностики токсоплазмоза животных, включающий заражение возбудителем белых мышей, получение паразитарной массы, ее очистку от балластных компонентов,центрифугирование и отделение целевого продукта(А.с. СССР 533376, кл. А 61 В 10/00, 1976). Недостатком указанного способа получения антигена является присутствие в целевом продукте значительного количества балластных компонентов,таких, как форменные элементы, что снижает его реакционную способность и обусловливает невысокую специфическую активность антигена. Задачей изобретения является разработка способа получение антигена для серологической диагностики токсоплазмоза животных, вызываемых, обеспечивающего получение высокочувствительного, высокоспецифичного и наиболее чистого антигена. Технический результат,обеспечиваемый изобретением выражается в получении высокоактивного и стабильного антигена для постановки серологической реакции при диагностике токсоплазмоза животных. Способ получения антигена для серологической диагностики токсоплазмоза животных, включающий заражение возбудителем белых мышей, получение паразитарной массы, ее очистку от балластных компонентов, центрифугирование и отделение целевого продукта, в качестве материала для антигена используют штаммР-0175 СКС 1112 КазНИВИ, которым заражают белых мышей, затем берут внутрибрюшинный экссудат, который центрифугируют при 6000 об/мин в течение 15 мин, отделяют осадок от надосадочной жидкости, проводят отделение токсоплазм от форменных элементов внутрибрюшинного экссудата путем отстаивания, затем разрушают полученные клетки культуры токсоплазм трехкратным воздействием ультразвука при частоте 22 кГц и мощностью 100 Вт/ см 2 с интервалом 30 мин, после чего полученную суспензию центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин,осадок удаляют, а к надосадочной жидкости добавляют 96 раствор этилового спирта в соотношении 13 соответственно, тщательно перемешивают и выдерживают в течение 10 час при температуре 5 С, полученный осадок вновь центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин,надосадочную жидкость отбрасывают, осадок растворяют в физиологическом растворе рН до 8,5 и доводят концентрацию белка до 1 мг/см 3 и рН до 7,2-7,5. В изобретении используется штамм генофонда микроорганизмов ТОО Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт. Пример 1. Для получения антигена для серологической диагностики токсоплазмоза животных используют штаммР-0175 СКС 1112 КазНИВИ. Штамм характеризуется следующими признаками,которыми обладает. Морфологические признаки. ШтаммР-0175 СКС 1112 КазНИВИ обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя токсоплазмоза животных. Окраска по Романовскому-Гимза цитоплазма окрашивается в голубой цвет различной интенсивности, ядро - в красно-фиолетовый. Культуральные свойства. Форма и цвет - паразит имеет полулунную форму, похожую на дольку апельсина размером 3-5 мкм цвет серый. Очертания концов - передний конец трофозоита застроен,задний расширен и закруглен. Кислотоустойчивость- неустойчива при рН менее 5,5. Тип клеточной стенки-вегатативные формы токсоплазм покрыты сложно устроенной поверхностной структурой двумя оболочками толщиной по 8 нм и промежуточным осмиофобным слоем толщиной 9-10 нм. Каждая оболочка представляет собой элементарную мембрану. Она трехслойна и состоит из 2 осмиофильных слоев (по 2,5 нм) и промежуточного осмиофобного соля (3 нм). Все вместе взятые поверхностные структуры токсоплазм имеют толщину 25 нм, и их можно называть стенкой. Токсоплазмы размножаются в макрофагах путем эндодиогении - внутренного почкования с образованием двух дочерних клеток (эндозоиты) внутри материнской. Процесс начинается с деления ядра, которое принимает гантеле- или подковообразную форму. Параллельно формируются мембранные структуры дочерних клеток, путем разрыва оболочки материнской клетки освобождаются две дочерние. Помимо процесса эндодиогении,токсоплазмы могут размножаться путем эндополигении с образованием более чем двух дочерних особей. Биохимические свойства. ШтаммР-0175 СКС 1112 КазНИВИ аэроб. Культивирует только живом организме белых мышей. Питание осмотическое (сапрофитное),чувствительна к антибактериальным агентам(бисептол и пр.). Токсоплазма устойчива к химическим реагентам, в частности, зигоцисты к 1,5 - серной кислоте, 2,5 - дихромату кальция,20 - этанолу, 10 - смеси этанола и эфира, 1 соляной кислоте, 1 - фенолу. В стадии ооцист при комнатной температуре - до 12 мес Псевдоцисты при 4 С - до 12 дней. Зоиты в тканевом экссудате до 1 мес. При 45 С-15 мин, при 50 С-погибает моментально. Оптимальны рН 5,8-6,4. Антигенные свойства. На введения культуры штамма в организме лошадей, кроликов и морских свинок образуются специфические агглютинины в титрах 1 40 - 11280. Иммунохимические - при использованиив качестве патогенный модели на белых мышах установлено, что дендритические клетки являются потенциально ранними продуцентами -12 паразито специфического иммунитета и секреции ( ). Титры антител в РСК и РДСК 140. Патогенные свойства. ШтаммР-0175 СКС 1112 КазНИВИ патогенен для человека, белых мышей, кроликов и других животных. Вирулентность штамма сохраняется в стерильном физиологическом растворе (рН 5.8-6.4 при 16-18 С до 14 сут. а при 3-5 С- 30 дней, в экссудате из брюшной полости при 5-8 С- до 7 дней, в кипяченной и сырой воде - до 48 час.). Иммуногенность. Нет. Реактогенность. ШтаммР 0175 СКС 1112 КазНИВИ сильно реактогенен для животных внутримышечном введении. Спророобразование. Специализированные клетки не образуются. Реверсабельность и реактогенность. Штамм не отличается от эпизоотических изолятов, обладает высокой активностью при подкожном введении. Стабильность свойств при пассировании. Основные биологические свойства штамма грибаР-0175 СКС 1112 КазНИВИ стабильно сохраняются на организм белых мышах при условии постоянных пересевов (3 раза в месяц),не ослабляя патогенные свойства. ШтаммР-0175 СКС 1112 КазНИВИ культивируется путем инфицирования лабораторных животных (белых мышей) или на культуре тканей (культура куриных фибробластов, клетки почек свиньи, почек обезьян,СОЦ, Нер-2 и др.). Пример 2. Для получения токсоплазменного антигена используют периотонеальный экссудат белых мышей, зараженных штаммомР-0175 СКС 1112 КазНИВИ. Для этого берут белых мышей весом 18-20 г партиями по 100200 голов. Экссудат для заражения разводят стерильным физиологическим раствором так, чтобы в поле зрения микроскопа увеличения 1540 были видны 4-5 токсоплазм. Доза заражения мышей - 0.2 мл. На 4-5 сутки после заражения мышей наркотизируют эфиром и стерильным шприцем из брюшной полости собирают периотонеальный экссудат. Затем центрифугируют при 6000 об/мин в течение 15 мин, отделяют осадок от надосадочной жидкости, проводят отделение токсоплазм от форменных элементов внутрибрюшинного экссудата путем отстаивания, потом разрушают полученные клетки культуры токсоплазм трехкратным воздействием ультразвука при частоте 22 кГц и мощностью 100 Вт/ см 2 с интервалом 30 мин,после чего полученную суспензию центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин, осадок удаляют, а к надосадочной жидкости добавляют 96 раствор этилового спирта в соотношении 13 соответственно, тщательно перемешивают и выдерживают в течение 10 час при температуре 5 С, полученный осадок вновь центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин,надосадочную жидкость отбрасывают, осадок растворяют в физиологическом растворе рН до 8,5 и доводят концентрацию белка до 1 мг/см 3 и рН до 7,2-7,5. Пример 3. При титровании комплемента морской свинкой в реакции связывания комплемента (РСК) в присутствии физиологического раствора (контроль) и приготовленного антигена в рабочем титре полученные одинаковые титры комплемента, что свидетельствует об отсутствии антикомплементарного свойства приготовленного антигена. При постановке реакции связывания комплемента с 3 сыворотками крови лошадей больной трипаносомозом, 3 пробами сыворотки крови крупного рогатого скота, спонтанно больного безноитозом с использованием приготовленного антигена получен отрицательный результат. Активность полученного описанным способом антигена была проверена в лабораторных условиях при постановке РСК/РДСК с сыворотками крови от здоровых и больных животных. Результаты оценки активности предлагаемого антигена для РСК/РДСК при токсоплазмозе животных приведены в таблице 1. Из таблицы 1 видно, что антиген, полученный описанным способом,с серопозитивными сыворотками в разведениях 15 и 110 дает положительные результаты при разведении антигена 1200,с серонегативными дает отрицательные результаты, что доказывает его достаточно высокую активность и специфичность. Это позволят использовать его в качестве антигена для РСК/РДСК,обладающего высокой чувствительностью в выявлении токсоплазмоз животных. Таким образом, приготовленный токсоплазменный антиген является высокоспецифичным, не обладает антикомплементарным свойством. Готовый антиген расфасовывают в стерильные ампулы по 1 мл подвергают сублимационной сушке. Антиген может храниться до 6 мес. при температуре 4 С и в лиофилизированном виде 2-3 года, не теряя своего исходного титра. Перед использованием его необходимо титровать с положительными и отрицательными сыворотками. Предложенный способ получения антигена для серологической диагностики токсоплазмоза животных обеспечивает высокую активность и специфичность антигена, что позволяет повысить достоверность серологических реакций. Таблица 1 Оценка активности предлагаемого антигена для РСК/РДСК при токсоплазмозе животных Наименование Положительной Наименование Отрицательной Контроль (физ. раствор) ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения антигена для серологической диагностики токсоплазмоза животных, включающий заражение возбудителем белых мышей, получение паразитарной массы, ее очистку от балластных компонентов, центрифугирование и отделение целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве материала для антигена используют штаммР-0175 СКС 1112 КазНИВИ,которым заражают белых мышей, затем берут внутрибрюшинный экссудат, который центрифугируют при 6000 об/мин в течение 15 мин, отделяют осадок от надосадочной жидкости, проводят отделение токсоплазм от форменных элементов внутрибрюшинного экссудата путем отстаивания, Разведение антигена 150 1100 1200 затем разрушают полученные клетки культуры токсоплазм трехкратным воздействием ультразвука при частоте 22 кГц и мощностью 100 Вт/см 2 с интервалом 30 мин, после чего полученную суспензию центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин, осадок удаляют, а к надосадочной жидкости добавляют 96 раствор этилового спирта в соотношении 13 соответственно, тщательно перемешивают и выдерживают в течение 10 час при температуре 5 С, полученный осадок вновь центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 мин,надосадочную жидкость отбрасывают, осадок растворяют в физиологическом растворе рН до 8,5 и доводят концентрацию белка до 1 мг/см 3 и рН до 7,2-7,5.