Способ подбора доз варфарина на основе генотипирования для казахской популяции

(51) 61 31/353 (2006.01) 61 7/02 (2006.01) 01 33/48 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ фармакогеномике, и может быть использовано для подбора индивидуальных дозировок лекарственных средств на основе генетических данных пациента,предотвращения риска развития побочных реакций при приеме лекарственных средств, повышения эффективности лечения лекарственными препаратами, снижения экономических расходов,связанных с неоправданным использованием универсальных доз лекарственных препаратов. Предложен способ подбора дозировки Варфарина на основе генотипирования полиморфизмов единичного нуклеотида с учетом характерных особенностей казахской популяции. Данная схема позволит проводить генотипирование по 5 наиболее оптимальным и клинически значимым полиморфизмам единичного нуклеотида(1639),(1958), 42 (1297 с учетом особенностей распространенности аллелей для казахской популяции.(72) Искакова Айша Нурбековна Романова Алия Аделовна Кожахметова Сания Саттыбаевна Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ПОДБОРА ДОЗ ВАРФАРИНА НА ОСНОВЕ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ДЛЯ КАЗАХСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ Область техники, к которой относится изобретение. Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно, к фармакогеномике, и может быть использовано для решения актуальных задач современной медицины,в частности, для подбора индивидуальных дозировок лекарственных средств на основе генетических данных пациента, тем самым,уменьшая риск развития побочных реакций при приеме лекарственных средств,повышая эффективность лечения лекарственными препаратами. А это, в свою очередь, приводит к снижению экономических расходов, связанных с неоправданным использованием универсальных доз лекарственных препаратов и т.д. Как известно, эффективность и переносимость одних и тех же лекарственных средств у различных больных неодинакова. Это связано с тем, что ферменты, отвечающие за биотрансформацию лекарственных препаратов, могут снижать или повышать свою активность за счет мутаций в генах,отвечающих за синтез этих ферментов. В зависимости от характера мутации гена изменяется скорость синтеза фермента или синтезируется атипичный фермент. Генетические особенности пациентов обусловливают около 50, а по некоторым данным и до 90 всех неблагоприятных ответов на лекарственные средства (неэффективность и/или нежелательные лекарственные реакции). Уровень техники. На сегодняшний день существует множество методов для определения генотипа человека. Наиболее распространенными являются метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени ( - ), анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, ДНК-микроэррей ( - ) и метод прямого секвенирования . Метод прямого секвенирования является золотым стандартом при генотипировании полиморфизмов единичного нуклеотида, т. к. другие обладают рядом серьезных недостатков (малая дискриминирующая способность,дороговизна метода, трудоемкость и сложность метода). Аналоги изобретения. Основанная на методе полимеразной цепной реакции в режиме реального времени тест-система( , ) является быстрым, однако высок риск неправильной интерпретации результатов даных анализа. Тест разработан для генотипирования полиморфизмов единичного нуклеотида только 2 генов по 3 позициям В предлагаемом нами способе проводится генотипирование 4 генов по 5 позициям (292(С 430 Т), 293 (А 1075 С), 1 (1639), (1958), 42 (1297, т. . совпадение с вышеуказанным аналогом только по 2 генам 3 позициям (292 (С 430 Т), 293(А 1075 С), 1 (1639. Генотипирование проводится методом прямого секвенирования. Данный аналог является наиболее близким заявляемому нами способу генотипирования. Одобренная Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (, ) тест-система(,., , ) на основе метода гибридизации является достаточно быстрым, однако требует специфичного оборудования ////. Тест разработан для генотипирования полиморфизмов единичного нуклеотида 2 генов по 3 позициям(1 1173 СТ,292,СР 2 С 93). В предлагаемом нами способе проводится генотипирование 4 генов по 5 позициям (292(С 430 Т), 293 (А 1075 С), 1 (1639), (1958), 42 (1297 А, т. . совпадение с вышеуказанным аналогом только по 1 гену 2 позициям (292 (С 430 Т), 293 (А 1075 С. По гену 1 определяются разные аллельные полиморфизмы. В нашем способе 1639, в аналоге - 1173 СТ. Однако группой авторов. было выявлено, что полиморфизм 1173 СТ ассоциирован с полиморфизмом 1639 1.,,..1-.2005 105645-649.37.исследованные авторами пациенты с генотипом 1639 АА имели генотип 1173 ТТ, 1639 были ассоциированы с генотипом 1173 СТ и 1639 были ассоциированы с генотипом 1173 СС. Подобные результаты были получены и нами. На основании этих данных можно сделать вывод, что для определения дозировки Варфарина необходимо генотипировать только один из двух аллельных полиморфизмов. По генотипу первого можно определить генотип второго , т.к. они сцеплены. Генотипирование, в предлагаемом нами способе,проводится методом прямого секвенирования. С помощью ДНК-микроэррея 450 29-1 (, .,СА) возможно генотипировать 13 позиций полиморфизмов единичного нуклеотида, однако только по 2 генам (292, 293, 294,295, 296, 2911, 1 1639, 2255, 698, 358, 1173 СТ,3730,1542)/29 В предлагаемом нами способе проводится генотипирование 4 генов по 5 позициям(1639),(1958), 42 (1297. Генотипирование по аллельным полиморфизмам 295, 296, 2911 не иммет смысла,т.к., согласно данным нашего исследования и литературным данным, не встречаются в казахской популяции. Клинически значимымипо гену 1 на сегодняшний день считаются 1639,1173 СТ,3730,однако типирование одновременно всех трех вариантов 1 1639, 1173 СТ, 3730 не имеет смыла, т.к. данные мутации сцеплены. Генотипирование, в предлагаемом нами способе, проводится методом прямого секвенирования. ДНК-микроэррей-8( , ., ). Тест разработан для генотипирования полиморфизмов единичного нуклеотида только 2 генов по 3 позициям (1 1639, 292, 2 С 93) В предлагаемом нами способе проводится генотипирование 4 генов по 5 позициям (292(С 430 Т), 293 (А 1075 С), 1 (1639), (1958), 42 (1297 А, т. . совпадение с вышеуказанным аналогом только по 2 генам 3 позициям (292 (С 430 Т), 293(А 1075 С), 1 (1639. Генотипирование,в предлагаемом нами способе, проводится методом прямого секвенирования. Для расчета оптимальной дозировки Варфарина существует несколько подходов. На основе генотипа и физикальных характеристикЕА и соавт.ЕА,,НА,.291.20051062329-33. была разработана математическая формула расчета начальной дозы Варфарина, в которой учитывались такие параметры, как возраст, рост и данные генотипирования 292, 293 и 1. Начальная доза 0,628 - 0,0135(Возраст) - 0,240- 29 в зависимости от генотипа равен 1 при гетерозиготном носительстве аллельных вариантов соответствующих аллельных вариантов (генотипы 29/2 или 29/3),а при гомозиготном носительстве (генотипы 292/2 или 293/3) равен 2. . . . 2008 был предложен алгоритм, в котором учитывались такие параметры,как возраст, расовая принадлежность, пол, значение целевого МНО, площадь поверхности тела (исходя из роста и веса), взаимодействие Варфарина с Амиодароном и статинами,и данные генотипирования 292, 293. Начальная дозаехр(0,3850,0083 хвозраст 0,498 ППТ 0,208292 -0,350293 0,341(амиодарон)0,378 целевое МНО 0,125(статин) - 0,113(раса) - 0,075 (жен.пол где ППТвес (кг) 0.425 рост (см) 0.7250.007184. Если пациент принимает амиодарон или статин(флувастатин или симвастатин), в формулу подставляется 1, если нет - 0. Тоже касается и совместного применения амиодарона. Если больной относится к европеоидной расе, в формулу необходимо подставить 1, для представителей других рас 0 если расчет дозы Варфарина ведется для женщины, необходимо подставить 1, для мужчины - 0 (Сычев Д.А., 2007, с.59-66).и соавт.,,..20071162563-70. была предложена формула, в которой учитывались возраст, пол, вес и данные генотипирования 292, 293 и 1 для расчета еженедельной дозы. Прогнозируемая недельная дозировка 1,64 ехр 3,98411(0)12 (-0,197)13 (-0,360)23(-0,947)22(-0,265)33(-1,895)(-0,304)-(-0,569) -СС(0)возраст(0,003) На основании этих и др. исследований на сайте был разработан алгоритм расчета дозировки Варфарина, учитывающий все вышеперечисленные параметры. Более простой алгоритм был предложен М.и соавт.М,,,.29.. 2006 39(6) 606-12 Авторы рассчитали средние рекомендованные начальные дозы Варфарина для пациентов разных этнических групп и разных патологий в зависимости от результатов фармакогенетического тестирования по 29 (Фиг.1). Для получения начальной дозы Варфарина вместонеобходимо подставить 2 или 3,в зависимости от соответствующего выявленного генотипа. Немного другой подход к дозированию Варфарина предложилии соавт.,М,- . 29. . .. 200475(3) 198-203 Он заключается в том,что необходимо проводить коррекцию дозировки Варфарина на основе генотипа человека после назначения стандартной дозы. Сущность изобретения заключается в разработке алгоритма подбора доз Варфарина на основе генотипирования оптимального, для казахской популяции, набора полиморфизмов единичного нуклеотида методом прямого секвенирования. Генотипирование 4 основных генов по 5 позициям(29, 1, , 42), участвующих в метаболизме Варфарина, позволяет подбирать более точную дозировку Варфарина. В наиболее близком аналоге, приведенном в разделе уровень техники типирование проводится только по 2 генам 3 позициям методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Задачей изобретения является оптимизация генотипирования полиморфизмов единичного нуклеотида 292(А 1075 С), 1 (1639),(1958),42 (1297) для подбора индивидуальной дозировки Варфарина для казахской популяции, тем 3 самым повышая эффективность лечения и снижая риск возникновения побочных реакций. Технический результат. Технический результат изобретения достигается благодаря тому, что предложена оптимальная схема генотипирования полиморфизмов единичного нуклеотида для казахской популяции. Данная схема позволит проводить генотипирование по 5 наиболее оптимальным и клинически значимым полиморфизмам единичного нуклеотида (292(С 430 Т), 293 (А 1075 С), 1 (1639), (1958), 42 (1297 с учетом особенностей распространенности аллелей для казахской популяции. Такой подход позволит максимально снизить риск развития нежелательных лекарственных реакций (побочные эффекты или неэффективность лечения), способствует снижению экономических расходов,связанных с неоправданным использованием основного лекарственного препарата, препаратов, которые используются для ликвидации последствий побочных реакций. Сведения,подтверждающие возможность осуществления изобретения. Для определения индивидуальной дозировки Варфарина необходимо провести ряд манипуляций. Сущность изобретения поясняется следующим конкретным примером Пример 1 1) Выделение ДНК из венозной крови пациента,либо из букальных клеток пациента. 2) Амплификация фрагментов генов,содержащие области анализируемых полиморфизмов, с помощью полимеразной цепной реакции с использованием олигонуклеотидных пар праймеров. Готовится 5 реакционных смесей для определения 5 клинически значимых аллельных полиморфизмов 292 (С 430 Т), 293(А 1075 С), 1 (1639),(1958),42 (1297), которые были подобраны с учетом особенностей распространенности аллелей для казахской популяции 3) Анализ продуктов амплификации методом электрофореза в 2 агарозном геле в -буфере,с последующей окраской бромистым этидием. 4) Идентификация точечных однонуклеотидных замен на основе ДНК - секвенирования с применением набора 3.1(3730, фирмы) согласно протоколу производителя. Для анализа данных используется пакет программ.0. 5) После определения генотипа 5 аллельных полиморфизмов 292 (С 430 Т), 293(1297 вносят данные в соответствующие поля на сайте, с учетом таких параметров,как возраст, расовая принадлежность, пол, значение целевого МНО, площадь поверхности тела (исходя из роста и веса), взаимодействие Варфарина с Амиодароном и статинами. 6) Система в режиме - подсчитывает необходимую дозировку Варфарина. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ подбора дозировки Варфарина,включающий типирование клинически значимых генов, таких как 29 (292, 293), (1639), отличающийся тем, что дополнительно у предствавителей казахской популяции проводят генотипирование по 2 генам 2 аллельным полиморфизмам(1958),42 (1297).