Способ диагностики висцерального кандидоза легких у больных муьтирезистетнтным туберкулезом легких хирургического профиля.

(51) 01 33/48 (2011.01) 01 33/49 (2011.01) 01 33/53 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Способ диагностики висцерального кандидоза у больных мультирезистентным туберкулезом легких хирургического профиля включает бактериологическое исследование патологического материала посевом на среду Сабуро,иммунологическое исследование крови на наличие . противокандидозных антител ( ) и гистологическое исследование резецированной ткани легкого. При росте колонийболее 5102 КОЕ/мл трехкратно, либо 1103 КОЕ/мл однократно, при обнаружении титраантител более 0,300 ед. оп. пл. и обнаружении кандид в резецированной ткани легких диагностируют висцеральный кандидоз. Применение предлагаемого способа позволяет значительно увеличить объективность диагностики висцерального кандидоза при туберкулезе легких и позволяет своевременно откорректировать комплексное лечение данной сочетанной патологии.(72) Абилдаев Тлеухан Шилдебаевич Аленова Арике Хамзовна Белова Елена Сергеевна Бисмилда Венера Лазаревна Игликова Шолпан Кенбаевна(73) Республиканское государственное казенное предприятие Национальный центр проблем туберкулеза Республики Казахстан Министерства здравоохранения Республики Казахстан(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВИСЦЕРАЛЬНОГО КАНДИДОЗА ЛЕГКИХ У БОЛЬНЫХ МУЬТИРЕЗИСТЕТНТНЫМ ТУБЕРКУЛЕЗОМ ЛЕГКИХ ХИРУРГИЧЕСКОГО ПРОФИЛЯ.(57) Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии и может быть использовано для диагностики висцерального кандидоза. Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии и может быть использовано для диагностики висцерального кандидоза у больных мультирезистентным туберкулезом легких (МЛУ ТБ) хирургического профиля. Лечение туберкулеза, особенно МЛУ ТБ,. требует длительного применения химиопрепаратов,антибиотиков, гормональных средств. На этом фоне у больных формируется вторичное иммунодефицитное состояние и, как следствие,нередко развивается кандидоз, который отягощает клиническое течение инфекционного заболевания и значительно ухудшает прогноз. Диагностика кандидоза, а особенно висцерального, при туберкулезе легких представляет большие трудности, так как любые проявления вторичной инфекции могут протекать под маской обострения туберкулезного процесса, что нередко приводит к изменению тактики лечения и требует проведения оперативного вмешательства. Поэтому,качественная, своевременная диагностика и лечение сопутствующей патологии,в особенности,висцерального кандидоза у больных туберкулезом легких хирургического профиля имеет важное практическое значение. Известен- способ диагностики кандидоза,включающий бактериологическое исследование патологического материала посевом на среду Сабуро.(Реброва Р.Н. Грибы родапри бактериальных инфекциях.-М Медицина, 1969252). Недостатком данного способа является то, что на основании этого способа нельзя установить диагноз висцерального кандидоза, а верификация диагноза на основании одного положительного результата бактериологического посева мокроты на грибки в титре 500 КОЕ/мл завышает истинное количество больных туберкулезом легких с сопутствующим кандидозом (по данным разных авторов от 20,7 до 73,8 случаев). Задачей изобретения является разработка способа диагностики висцерального кандидоза легких у больных МЛУ ТБ хирургического профиля, который в отличие от прототипа увеличивает объективность диагностики кандидоза,в том числе и висцерального. Техническим результатом изобретения является повышение эффективности диагностики висцерального кандидоза за счет комплексного обследования больного МЛУ ТБ и разработанных диагностических критериев кандидоза, исключение гипердиагностики. Указанный технический результат достигается тем, что в способе диагностики кандидоза,включающем бактериологическое исследование патологического материала с посевом на среду Сабуро, отличительной особенностью, согласно изобретению, является то, что у больных мультирезистентным туберкулезом легких хирургического профиля дополнительно осуществляют иммунологическое исследование крови на наличие противокандидозных антител( ) и гистологическое исследование резецированной ткани легкого, и при росте колонийболее 510 КОЕ/мл трехкратно,либо 110 КОЕ/мл однократно, при обнаружении титраантител более 0,300 ед. оп. пл. и обнаружении кандид в резецированной ткани легких диагностируют висцеральный кандидоз. Способ осуществляется следующим образом Больному проводится обследование на предмет выявления висцерального кандидоза тремя диагностическими методами бактериологическим,иммунологическим и гистологическим. При поступлении на стационарное лечение больному проводится бактериологическое исследование мокроты на грибки. Для этого патологический материал (мокрота) собирается в стерильную посуду, затем культивируется на среду Сабуро (на двух чашках) в течение одной недели. Просмотр посевов производится ежесуточно. На вторые-третьи сутки учитывают выросшие колонии грибов по следующим признакам 1. характер поверхности(возвышающиеся, иногда вросшие в питательную среду). Перечисленные признаки позволяют идентифицировать выросшие колонии как грибы рода , Для оценки массивности роста определяют число выросших колоний и подсчитывают число колоний на каждой из двух засеянных чашках. По результатам подсчетов вычисляют среднее арифметическое и пересчитывают количество колоний на 1 мл патологического материала для определения количества колониеобразующих единиц (КОЕ/мл). Например на первой чашке выросло 57 колоний, на второй 77 колонии, в сумме 134 колонии. Среднее арифметическое равняется 67 КОЕ (134267) из 0,1 мл. В пересчете на 1 мл получается 670 КОЕ/мл. На первой неделе госпитализации проводится иммуноферментный анализ крови с определением титра противокандидозных антител . Для чего использован метод непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. Для проведения ИФА используются готовые наборы реагентов (КАНДИДОЗ-, Новосибирск, Россия). Постановка реакции осуществляется строго по прилагаемой инструкции. Перед работой к 96,0 мл дистиллированной воды добавляют 4,0 мл раствора ФСБ-Т (на 2 стрипа). В лунки планшета, заполняя их до краев, вносят рабочий раствор ФСБ-Т. Стрипы выдерживают 1 минуту при комнатной температуре, затем содержимое лунок сливают, остатки влаги удаляют,постукивая перевернутыми стрипами по фильтровальной бумаге. Исследуемые образцы сывороток разводят рабочим раствором ФСБ-Т в соотношении 1200. При этом 10 мкл исходной исследуемой сыворотки добавляют к 190 мкл рабочего раствора ФСБ-Т(разведение 120),затем после перемешивания 20 мкл этого разведения добавляют 2 к 180 мкл рабочего раствора ФСБ-Т (разведение 1200). Положительный контрольный образец (К) используют без разведения. 100 мкл отрицательного контрольного образца (К-) добавляют к 1,0 мл рабочего раствора ФСБ-Т,тщательно перемешивают. В лунки планшета вносят по 100 мкл контрольных образцов. В остальные лунки вносят по 100 мкл разведенных в 1200 исследуемых сывороток. Инкубируют в течение 30 мин. Затем промывают 5 раз, высушивают, добавляют по 100 мкл рабочего раствора коньюгата. Повторно инкубируют в течение 30 мин, а затем также промывают 5 раз и высушивают. Вносят по 100 мкл рабочего растворатетраметилбензидина. Планшет закрывают крышкой и выдерживают в темном месте в- течение 25 мин. Останавливают реакцию добавлением 100 мкл стопреагента. Результаты анализа регистрируют на иммуноферментном анализаторе,измеряя оптическую плотность (ОП) при длине волны 450 нм. Для оценки результатов анализа вычисляют критический уровень оптической плотности (ОП Крит) ОП Крит.ОПКотр 0,25. Если значение ИФА выше ОП Крит, то результат считается положительным, если ниже ОП Крит, то результат считается отрицательным. По окончании интенсивной фазы лечения больному проводят оперативное лечение по поводу туберкулеза легких. Резецированную ткань легкого направляют в патоморфологическую лабораторию,где приготавливаются стеклопрепараты и окрашиваются по Ван Гизону и Грамм-Вейгерту. Окрашенные по Ван Гизону приготовленные стеклопрепараты выдерживают в ксилоле 1-2 минуты, в спирте 96 С в течение 2 минут, хорошо прополаскивают в воде. Затем окрашивают в гематоксилине Вейгерта в течение 3 минут, тщательно прополаскивают в воде 5 минут. Окрашивают в пикрофуксине 2-3 минуты, быстро споласкивают вводе, проводят через 96 С этиловый спирт,просветляют и заключают в бальзам. Окрашивание по Грам-Вейгерту вначале срез окрашивают литиевым кармином Орта около 10 минут и переносят в 1 солянокислый спирт на время не менее 5 минут. Несколько минут промывают в чистой воде и окрашивают анилиновым генцианвиолетом 5-10 минут,профильтрованным через фильтровальную бумагу. После окрашивания прополаскивают в воде,выдерживают в растворе Люголя 3 минуты,отжимают фильтровальной бумагой,дифференцируют в анилиновом масле до тех пор,пока срез из синего вновь не станет красным,приблизительно 4 минуты. Обрабатывают ксилолом. Анилиновое масло тщательно удаляют, для чего ксилол применяют повторно, чередуя данную процедуру с отжиманием фильтровальной бумагой. Затем заключают в бальзам. При положительном результате в процессе гистологического исследования ткани легкого обнаруживаются элементы грибов кандида в виде округлых телец. Предлагаемый способ использован в клинической практике. Клинический пример 1 Больной А., 45 лет, находился на стационарном лечении в отделении хирургического лечения туберкулеза легких с 27.07.06 по 26.10.06 с клиническим диагнозом Фиброзно-кавернозный туберкулез верхней доли правого легкого в фазе инфильтрации и обсеменения, МБТ-, рецидив,МЛУ ТБ,категория. Жалобы при поступлении на повышение температуры тела до 37,3 С, боли в грудной клетке справа, одышку при физической нагрузке. Больной выявлен по обращаемости, диагноз туберкулеза установлен через 2 месяца от начала заболевания. Контакт с больным туберкулезом отрицает. Получил полный курс химиотерапии покатегории,интенсивную фазу в условиях стационара, поддерживающую фазу - амбулаторно. Через полгода после завершения химиотерапии появились вышеперечисленные жалобы, был дообследован и госпитализирован в национальный центр проблем туберкулеза Республики Казахстан(НЦПТ РК). Общее состояние средней тяжести, за счет умеренно выраженных симптомов интоксикации. Кожный покров и видимые слизистые чистые,бледные. Пальпируютсяподмышечные,подчелюстные,паховые периферические лимфоузлы, безболезненные, не спаянные с окружающей тканью, И-Ш размера. Аускультативно справа дыхание ослаблено,выслушиваются единичные влажные хрипы. ЧД 28 в 1 минуту. Сердечные тоны ритмичные, на верхушке выслушивается систолический шум функционального характера, отмечается тахикардия до 100 ударов в 1 минуту. Живот мягкий,безболезненный, печень пальпируется у края реберной дуги, селезенка не увеличена. Симптом поколачивания отрицательный. Стул и диурез в норме. Общий анализ крови от 27.07.06 Эритроциты 3,31012/л, гемоглобин - 108 г/л, цветной показатель крови - 0,94, лейкоциты - 9,7109/л, п/я 3, с/я 71, лимфоциты - 35, моноциты - 1, СОЭ - 44 мм/ч. Общий анализ мочи от 27.07.06 соломенножелтого цвета, реакция -кислая, удельный вес 1031, прозрачность полная, белок - 0,066 г/л,эпителий плоский - единичные, лейкоциты - 1-0-1-2 в п/з, эритроциты - 2-3-6 в п/з, соли оксалатов ,слизь . Биохимический анализ крови от 27.07.06 билирубин - 10,62 мкмоль/л, АлАТ - 0,26 ммоль/л,тимоловая проба - 0,8 ед, ахар - 3,8 ммоль/л,мочевина - 6,1 ммоль, общий белок - 70,0 г/л. Бактериоскопия мокроты на микобактерии туберкулеза от 27, 28, 31.07.06 1, 1, 1. При трехкратном посеве мокроты на микобактерии 3 туберкулеза установлен положительный результат. При исследовании лекарственной чувствительности выявлена- устойчивость к противотуберкулезным препаратамиряда. Бак посев мокроты на вторичную флору и кандиды позволил выявить непатогенную флору, 600 КОЕ/мл. Иммунологический анализ крови при поступлении уровень ПТА 0,402 ед.оп.лл., ОПотр 0,157 ед.оп.пл., ОПпол 1,498 ед.оп.пл. Уровень противогрибковых антител- 1,127 ед.оп.пл., ОПотр 0,290 ед.оп.пл., ОПпол 2,190 ед.оп.пл. Уровень моноклональных антител 3- 45,4 -,32, 8 - 21, 16- 8, индекс 4/8 - 1,5 9550. НСТ спонтанный - 9, стимулированный полноксидонием - 20. Рентгено-томографически Справа ниже уровняребра до купола диафрагмы определяется гомогенное, высокой интенсивности затенение с косым нечетким контуром. На боковом снимке затенение соответствует расположению главной междолевой щели. Определяется снижение прозрачности на уровне 6 нижней доли легкого. Проекция верхней, средней долей без очаговых теней, корень несколько тяжист, справа на уровне переднего ската диафрагмы горизонтальный уровень жидкости. Слева синусы свободные. Тень сердца без особенностей. На основании клинико-рентгенологических данных выставлен клинический диагноз Фибрознокавернозный туберкулез верхней доли правого легкого в фазе инфильтрации и обсеменения, МБТ,рецидив, МЛУ ТБ,категория. На основании высокого титра С.вмокроте при бактериологическом исследовании (600 КОЕ/мл) у больного заподозрен висцеральный кандидоз. Больной поступил в отделение хирургического лечения туберкулеза легких на оперативное лечение. 10.10.06 проведена верхняя лобэктомия правого легкого. Резецированный материал легкого был направлен в патоморфологическую лабораторию с целью обнаружения кандидозного поражения. Исследование операционного материала больного проводилось по стандартизированной схеме, которая включала макроскопическую оценку патологического материала и его микроскопическое изучение. Гистологические препараты окрашивались для выявления грибов по Ван-Гизону и по Грамм-Вейгерту. Заключение Фибрознокавернозный туберкулез верхней доли правого легкого в сочетании с грибками , с фокусами диссеминации, что в сочетании с наличием противокандидозных антител классав крови(1,127 ед.оп.пл.) позволило подтвердить диагноз висцерального кандидоза и соответствующим образом откорректировать проводимое лечение(назначением перорально и парентерально двух противогрибковых препаратов, иммуномодулятора Полиоксидоний). Диагноз висцерального кандидоза у данного больного установлен на основании положительного результата бактериологического посева мокроты на грибки, иммунологического исследования крови на определение титра противокандидозных антител и выявления кандид в легочной ткани при гистологическом исследовании. С целью подтверждения эффективности предлагаемого способа в клинике Национального центра проблем туберкулеза МЗ РК был обследован. 191 больной мультирезистентным туберкулезом легких, подвергшийся оперативному лечению по поводу туберкулеза легких. Из них у 17 (8,9) больных висцеральный кандидоз установлен на основании положительного результата бактериологического посева мокроты на кандады,иммуноферментного анализа крови на кандиды и гистологического подтверждения. Таким образом,предложенный способ диагностики кандидоза у больных МЛУ ТБ легких вюгючающий микробиологическое - рост колоний более 5102 КОЕ/мл трехкратно, либо 1103 КОЕ/мл однократно морфологическое -гистологическое подтверждение(обнаружение кандид) иммунологическое - титрантител 0,300 ед. оп. пл. исследования, значительно увеличивает объективность диагностики висцерального кандидоза при туберкулезе легких и,следовательно,позволяет своевременно откорректировать комплексное лечение данной сочетанной патологии. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ диагностики кандидоза, включающий бактериологическое исследование патологического материала посевом на среду Сабуро,отличающийся тем,что у больных мультирезистентным туберкулезом легких хирургического профиля дополнительно осуществляют иммунологическое исследование крови на наличие противокандидозных антител( ) и гистологическое исследование резецированной ткани легкого, и при росте колонийболее 5102 КОЕ/мл трехкратно,либо 1103 КОЕ/мл однократно, при обнаружении титраантител более 0,300 ед. оп. пл. и обнаружении кандид в резецированной ткани легких диагностируют висцеральный кандидоз.