Способ приготовления экскреторно-секреторного антигена для серологической диагностики ларвального эхинококкоза животных

(51) 01 33/53 (2010.01) 61 39/40 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ ЛАРВАЛЬНОГО ЭХИНОКОККОЗА ЖИВОТНЫХ(57) Изобретение относится к ветеринарии, а именно к диагностике инфекционных болезней животных. Технической задачей изобретения является усовершенствование способа получения экскреторно-секреторного антигена для серологической диагностики ларвального эхинококкоза животных, которая достигается путем культивирования протосколексов в неполной синтетической среде Игла с последующей очисткой и концетрацией культуральной жидкости. В результате были определены параметры получения, очистки и использования экскреторносекреторного антигена протосколексов для серологической диагностики ларвального эхинококкоза животных.(72) Булашев Айтпай Кабыкешович Боровиков Сергей Николаевич Куйбагаров Марат Амангельдыевич Акибеков Оркен Султанхамитович Сураншиев Жанболат Амреевич Топан Сдбек Саттарлы(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЭКСКРЕТОРНО-СЕКРЕТОРНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в иммунологических тестах для серологической диагностики эхинококкоза животных и человека. В настоящее время основным способом прижизненной диагностики эхинококкоза у людей является рентгеноскопия. В ветеринарии существует внутрикожная проба Казони. В кожу животного в области шеи или в другом месте вводят 0,1-0,2 мл жидкости, взятой стерильно из эхинококкового пузыря. При положительной реакции у овец через 5-10 мин на месте инъекции появляется припухлость с красным ободком (диаметр 0,4-2,0 см),которая через 20 мин становится темно-багровой и отечной. Более выраженную реакцию получают от полноценного антигена, приготовленного из сколексов эхинококковых пузырей. Антиген, разведенный физиологическим раствором в соотношении 1750,вводят в толщу кожи верхнего века глаза овец в дозе 0,2 мл. Реакцию считают резко положительной, если припухлость свыше 18 мм положительной от 12 до 17 мм и сомнительной - до 9 мм диаметром. Измеряют припухлость через 1-3 ч штангенциркулем. Аллергическая - реакция при эхинококкозе дает положительные результаты начиная с 15-го дня после заражения (Абуладзе К.И. Паразитология и инвазионные болезни сельскохозяйственных животных. 1982). Несмотря на большой перечень, специфичность существующих способов серологической диагностики эхинококкоза оставляет желать лучшего. Кроме того, в данных способах используется визуальная(субъективная) оценка результата анализа, они не поддаются автоматизации и неудобны для проведения одновременно большого числа анализов. Главной трудностью в установлении верного диагноза является сложная природа используемых антигенов. В связи с этим остро стоит вопрос поиска новых способов получения специфических антигенов эхинококков,основанных на современных технологиях использования уникальных реагентов. Несмотря на успехи, достигнутые как в плане получения высокоочищенных антигенов паразита, так и в применении новых эффективных иммунотестов,прижизненная диагностика ларвального эхинококкоза,основанная на применении иммунологических реакций, остается одной из актуальных задач современной гельминтологии. Получение достаточного количества эффективного антигенного материала цестод почти всегда сопряжено с определенными трудностями, в первую очередь с наличием зараженных животных. В последнее время в гельминтологии, да и в других областях науки появились иммунодиагностические средства,разработанные на основе использования экскреторносекреторных антигенов эхинококков для изучения иммунитета,иммунодиагностики и иммунопрофилактики у животных, , 1982., 1982 1983., 1984). По своим диагностическим качествам они не уступают 2 антигенам гельминтов,полученных другими способами. При этом можно довольствоваться незначительным количеством исходного материала,что является немаловажным обстоятельством,особенно при цестодозах. Наиболее близким к предлагаемому изобретению(прототипом) является разработка ученых Института медицинских исследований (Индия). В результатах их исследований описывается получение экскреторносекреторного антигена путем культивирования метацестод Т.(от естественно зараженных свиней) в среде 1640 . Для этого метацестоды Т.отмывали фосфатно-солевым буфером,7.2 содержащим антибиотики (пенициллин 100 ед/мл и стрептомицин ед/мл) и культивировали в 20 мл среды,. ,.110 (2009) 38-45).смотря на очевидные достоинства описанного способа, поскольку для культивирования используется дорогая синтетическая среда -1640, себестоимость его очень высока. Предлагаемый способ получения экскреторносекреторного антигена протосколексов эхинококков предполагает использование неполной синтетической среды Игла, которая является значительно дешевле среды -1640 и позволяет применять данную модификацию при промышленном производстве диагностических тест-систем. Технической задачей изобретения является устранение отмеченных недостатков и усовершенствования способа получения экскреторносекреторного антигена для серологической диагностики ларвального эхинококкоза животных. В результате были определены параметры культивирования протосколексов эхинококков,получения и очистки продуцируемого ими экскреторно-секреторного антигена. Получение протосколексов осуществляли следующим образом Поверхность эхинококковых цист в легких и печени крупного и мелкого рогатого скота обрабатывали 70 этиловым спиртом и с помощью шприца аспирировали жидкость. Жидкость центрифугировали при 1000 об/мин в течение 15 минут, удаляли супернатант, а осадок, содержащий протосколексы отмывали стерильным физиологическим раствором содержащим антибиотики (2000 ЕД/мл пенициллина и 1 мг/мл стрептомицина). Жизнеспособность протосколексов определяли по наличию движения при подогревании. Культивирование протосколексов Отмытые протосколексы в количестве 200-300 штук в 50 мл неполной среды Игла с антибиотиками(1000 ЕД/мл пенициллина и 1 мг/мл стрептомицина) переносили в стерильные полистироловые матрацы объемом 200 мл (, Дания). Культивирование проводили при 37 и содержании СО 2 - 5. Отбор культуральной жидкости проводили через 48 часов. Для этого культуральную жидкость сливали с матраца в стерильные полипропиленовые пробирки объемом 50 мл и центрифугировали при 3000 об/мин - 10 мин. Супернатант, содержащий экскреторно-секреторный антиген диализовали против дистиллированной воды с помощью диализных трубок с размером пор 10 кД при температуре 4 в течение 24 часов. Концентрирование проводили с помощью пальчикового концентратора (, до 10 кД) в 10 раз. Использование экскреторно-секреторного антигена протосколексов приведены в следующих примерах. Пример 1. Для постановки непрямого варианта иммуноферментного анализа (ИФА) ячейки 96 луночного планшета для иммунологических реакций сенсибилизировали экскреторно-секреторным антигеном в концентрации 0,010 мг/мл) 0,05 М карбонат-бикарбонатном буфере 9,6, при 4 в течение ночи. Для удаления несвязавшегося антигена планшет отмывали 3 раза фосфатно-солевым буфером содержащим 0,5 твина-20 (ФСБ-ТВ). После этого вносили антителосодержащую жидкость в разведениях в количестве 0,1 мл и инкубировали при 37 в течение 60 минут. После инкубирования планшет отмывали описанным способом для удаления неспецифически связавшихся антител. Затем в лунки планшет вносили антивидовой коньюгат в объеме 0,1 мл и инкубировали при 37 в течение 1 часа. Повторяли процедуру отмывки для удаления несвязанных продуктов реакции и в лунки вносили по 0,1 мл раствора субстрата фермента (3,3, 5,5,). Планшет инкубировали 10-15 минут при комнатной температуре. Положительная реакция характеризуется окрашиванием раствора субстрата в синий цвет. Реакцию останавливали добавлением в лунки планшет раствора 0,5 М раствора серной кислоты. Результаты ИФА учитывали с помощью спектрофотометра с вертикальным потоком света (96,Австрия) при длине волны 450 нм. Для исследования использовали пробы сыворотки крови от крупного рогатого скота во внутренних органах которых при последующем убое были обнаружены поражения ларвальным эхинококкозом. В качестве отрицательного контроля использовали пробы от животных без видимых признаков эхинококкоза. Всего было исследовано 11 проб сывороток крови. Пример 2 Для постановки реакции иммунодиффузии (РИД) на поверхность обезжиренных предметных стекол,расположенных на строго горизонтальной поверхности, заливали расплавленную 1 агарозу(МР, США) до образования слоя толщиной 1,5 мм. После застывания агара с помощью специального трафарета и пробойника вырезали лунки диаметром 23 мм. В центральную лунку вносили 0,005 мл экскреторно-секреторного антигена, а в остальные - по 0,005 мл исследуемых сывороток крови в разведениях. Чашки Петри с предметными стеклами инкубировали во влажной камере не менее суток при комнатной температуре. Результаты реакции учитывали по наличию полос преципитации между лунками с антигеном и сыворотками крови. Для контрастирования полос преципитации препарат окрашивали раствором Кумасси -250 в течение 10-15 минут. Раствор красителя готовили следующим образом 5 г Кумасси растворяли в 1000 мл растворителя. Растворитель состоял из 450 мл дистиллированной воды, 450 мл этанола и 100 мл ледяной уксусной кислоты. После окрашивания геля проводили обесцвечивание раствором, состоящего из метилового спирта,уксусной кислоты и дистиллированной воды в соотношении 501040 соответственно. Для исследования использовали пробы сыворотки крови от крупного рогатого скота во внутренних органах которых при последующем убое были обнаружены поражения ларвальным эхинококкозом. В качестве отрицательного контроля использовали пробы от животных без видимых признаков эхинококкоза. Всего было исследовано 11 проб сывороток крови (таблица). Результаты тестирования сывороток крови КРС Титр специфических антител РИД В результате проведенных исследований методом ИФА и РИД были получены результаты,согласно которым полученный экскреторносекреторный антиген вступает в реакцию со специфическими антителами сыворотки крови в титрах 1400-112800 (ИФА) и 12-14 (РИД). Все позитивные пробы получены от животных с видимыми поражениями внутренних органов ларвальным эхинококкозом. Таким образом, тестирование экскреторносекреторного антигена протосколексов показало его специфичность и сероактивность в иммуноферментном анализе и реакции иммунодиффузии. Полученный антиген может найти применение как основной реагент тест-систем предназначенных для серологической диагностики ларвального эхинококкоза животных. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ приготовления экскреторносекреторного антигена для серологической диагностики ларвального эхинококкоза животных,отличающийся тем, что для культивирования протосколексов используют неполную синтетическую среду Игла.