Способ получения поликлональных антител к окситетрациклину

(51) 01 33/53 (2010.01) 61 39/40 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к иммунологии, а именно к способу получения поликлональных антител к окситетрациклину, необходимых для иммуно-ферментного анализа, а также других иммуноаналитических способов определения остаточного количества окситетрациклина в продуктах животноводства. Технической задачей изобретения является усовершенствование способа получения поликлональных антител к окситетрациклину,которая достигается за счет оптимизации схемы иммунизации лабораторных животных. В результате проведенных исследований было определено, что использованая схема иммунизации позволяет получать поликлональные антитела специфичные антибиотику окситетрациклину и активные в иммуноферментном анализе (ИФА) в титрах 13200-16400.(72) Булашев Айтбай Кабыкешович Куйбагаров Марат Амангельдыевич Боровиков Сергей Николаевич Сураншиев Жанболат Амреевич Жумалин Айбек Хасиетович Абильмагжанов Абай Беркутович Бадуанова Салима Дулатовна(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ОКСИТЕТРАЦИКЛИНУ Изобретение относится к иммунологии, а именно к способу получения специфических антител к окситетрациклину, необходимых для иммуноферментного анализа,а также других иммуноаналитических способов определения остаточного количества окситетрациклина в продуктах животноводства. В связи с невозможностью использования самих антибиотиков для получения специфических иммуноглобулинов (по своей химической природе антибиотики являются гаптенами), для этих целей используют конъюгиро-ванные препараты,полученные путем сшивания антибиотика с высокомолекулярным носителем. Известен способы получения поликлональных антител на гентамицин, предложенный учеными университета Оклахомы (Оклахома Сити, США). Для этого кроликов иммунизировали конъюгатом гентамицин-БСА, а через 4 дня на 5, 6, 7, 8, 11, 13,15 и 18 сутки вводили внутривенно гентамицин,сенсибилизированный на поверхности козьих эритроцитов. Описанная процедура получения специфических антител весьма трудоемкая, так как предполагает использование 2-х видов конъюгатов. Так же следует отметить большую вероятность возникновение анафилаксии при повторном внутривенном введении антигена, что очень часто регистрируется при иммунизации кроликов ( ,. , 1981). Учеными Научно-исследовательского центра Колледжа наук о жизни и технологий, Цзинаньского университета (Гуанчжоу, Китай) были получены и изучены поликлональные антител против хлорамфеникола с использованием в качестве иммуногена конъюгатов антибиотика с овальбумином и бычьим сывороточным альбумином. Не смотря на положительный результат, следует отметить, что в качестве лабораторных животных были использованы линейные мыши. Количество поликлональной сыворотки при этом крайне незначительно, что существенно ограничивает возможности ее использования ( -, -,..-. 2008-05.). Наиболее близким техническим решением по совокупности признаков и достигаемому положительному эффекту (прототипом) является разработка ученых Калифорнийского университета(Сан Диего, США). Для иммунизации кроликов авторами был использован конъюгат хлорамфеникола с бычьим гамма-глобулином. Схема иммунизации была довольно длительной и предполагала серию инъекции общей длительностью более 14 месяцев (., 1969, 17, 593.). Предлагаемый способ получения поликлональных антител к окситетрациклину предполагает иммунизацию кроликов препаратом конъюгата окси-тетрациклина с бычьим сывороточным альбумином. Технической задачей изобретения является усовершенствование способа получения поликлональных антител к окситетрациклину,которая достигается за счет оптимизации схемы иммунизации лабораторных животных (кроликов). Процедура получения поликлональных антител Препараты конъюгатов окситетрациклина с овальбумином (ОВА) и бычьим сывороточным альбумином (БСА) получали активацией реагентов ацетатом натрия (рН 5,5) и формальдегидом. Очистку конъюгатов от не связавшихся реагентов проводили на колонке (151,5 см) с сефадексом 25. Элюирование проводили с помощью буфера (рН-7,5). При этом собирали фракцию относящуюся к первому пику и использовали в качестве антигена при иммунизации. Кроликов иммунизировали конъюгатом окститетрациклина с БСА (ОКСТ-БСА) с равным количеством неполного адъюванта Фрейнда по ниже указанной схеме- 31-й день - 1 мл антигена подкожно в область спины в 5 точек- 35-й день отбор крови для исследования Для очистки сыворотки крови от антител,специфичных бычьему сыво-тоточному альбумину проводили реакцию адсорбции. Для этого в сыворотку крови вносили БСА до концентрации 10 мг/мл, инкубировали в течение 2 ч при 37 и центрифугировали при 5000 об/мин - 10 мин. Для дальнейших исследований использовали супернатант. Использование поликлональных антител приведены в следующих примерах. Пример 1. На поверхность обезжиренных предметных стекол заливали расплавленную 1 агарозу до образования слоя толщиной 1,5 мм. После застывания агара с помощью специального трафарета и пробойника вырезали лунки диаметром 2-3 мм. В центральную лунку вносили 0,005 мл конъюгата окситетрациклина с овальбумином(ОКСТ-ОВА), а в остальные - по 0,005 мл специфических антисывороток (поликлональных антител). Чашки Петри с предметными стеклами инкубировали во влажной камере не менее суток при комнатной температуре. Результаты реакции учитывали по наличию полос преципитации между лунками с ОКСТ-ОВА и антисыворотками. В результате проведенных исследований была зарегистрирована четкая линия преципитации между исследованной пробой поликлональных антител и гетерологичным конъюгатом ОКСТ-ОВА. Пример 2. Ячейки 96-луночного планшета для иммунологических реакций(,Дания) сенсибилизировали гетерологичным конъюгатом окси-тетрациклин-овальбумин (молекулярная масса 45 кД) в концентрации 0,005 мг/мл, при 4 в течение ночи. Для удаления несвязавшегося антигена планшет отмывали 3 раза фосфатносолевым буфером с содержанием 0,05 тви-на-20(ФСБ-ТВ). После этого вносили иммуную сыворотку крови в количестве 0,1 мл в разведениях и инкубировали при 37 в течение 60 минут. Далее планшет отмывали описанным способом для удаления неспецифически связавшихся антител. Затем в лунки планшет вносили антикроличьи антитела,меченные пероксидазой хрена(антивидовой коньюгат) в объеме 0,1 мл и инкубировали при 37 в течение 1 часа. Повторяли процедуру отмывки для удаления несвязанных продуктов реакции и в лунки вносили по 0,1 мл раствора субстрата фермента. Субстрат- ТМБ) вносили по 100 мкл и инкубировали планшет 10-15 минут при комнатной температуре. Положительная реакция характеризуется окрашиванием раствора субстрата в синий цвет. Реакцию останавливали добавлением в лунки планшет раствора 0,5 М серной кислоты. Раствор при этом окрашивается в лимонно-желтый цвет. Результаты ИФА учитывали с помощью спектрофотометра с вертикальным потоком света(96, Австрия) при длине волны 450 нм. Тестирование поликлональной сыворотки показало его специфичность и сероактивность в иммуноферментном анализе по отношению к окситетрациклину в титрах 13200-16400. Полученный препарат может найти применение как иммунореагент при определении остаточных количеств окситетрациклина в продуктах животноводства. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения поликлональных антител к окситетрациклину путем иммунизации кроликов конъюгатом окситетрациклина с бычьим сывороточным альбумином, отличающийся тем,чтопри этом проводят серию подкожных инъекций в течение 35 суток.