Способ получения конъюгата стрептомицина с бычьим сывороточным альбумином

(51) 61 31/11 (2010.01) 01 33/53 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН Изобретение относится к иммунологии, а именно к способу получения конъюгированного антигена стрептомицин - белок, который используется для получения антител к стрептомицину, необходимых для иммуноферментного анализа, а также других иммуноаналитических способов определения остаточного количества стрептомицина в продуктах животноводства. В связи с невозможностью использования самих антибиотиков для получения специфических иммуноглобулинов (по своей химической природе антибиотики являются гаптенами), для этих целей используют конъюгированные препараты,полученные путем сшивания антибиотика с высокомолекулярным носителем. Известны способы получения иммунных комплексов (антибиотик - белковый носитель) для таких антибиотиков, как неомицин, пенициллин и др. Для получения конъюгатов были использованы в качестве сшивающего агента реактив 3-этилкарбодиимид гидрохлорид (3-). ( , . ,1978,.. . , . , . ,(57) Изобретение относится к иммунологии, а именно к способу получения конъюгированного антигена стрептомицин белок,который используется для получения антител к стрептомицину, необходимых для иммуноферментного анализа, а также других иммуноаналитических способов определения остаточного количества стрептомицина в продуктах животноводства. Технической задачей изобретения является усовершенствование способа получения конъюгированного антигена стрептомицинбелковый носитель, которая достигается за счет активации компонентов глутаровым альдегидом. В результате проведенных исследований было определено, что использованный в качестве иммуногена конъюгат стрептомицин-БСА достаточно активен и позволяет получать специфические антитела сероактивные в иммуноферментном анализе (ИФА) в титрах 1320016400.,, . 2008,.). Наиболее близким техническим решением по совокупности признаков и достигаемому положительному эффекту (прототипом) является разработка ученых Государственного института контроля качества сельскохозяйственной продукции(Нидерланды) (,,,,....81998,181999.). Когда для получения конъюгата стрептомицина был использован активизированный эпоксидной смолой бычий сывороточный альбумин( БСА ), окись 0.5 М дейтерия натрия и (1,4- бутанэдиолдиглицидиловый эфир (1,4- ). Полученные в результате иммунизации кроликов данным препаратом специфические иммуноглобулины были успешно использованы для детекции стрептомицина в иммуноферментном анализе Несмотря на удовлетворительные результаты,полученные посредством описанного способа,(72) Булашев Айтбай Кабыкешович Куйбагаров Марат Амангельдыевич Боровиков Сергей Николаевич Сураншиев Жанболат Амреевич Абильмагжанов Абай Беркутович Акибеков Оркен Султанхамитович(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТА СТРЕПТОМИЦИНА С БЫЧЬИМ СЫВОРОТОЧНЫМ АЛЬБУМИНОМ 23832 процедура конъюгации очень сложна в исполнении и требует использования дорогостоящих реактивов. Предлагаемый способ получения конъюгата стрептомицин-БСА предполагает использовать в качестве сшивающего агента достаточно распространенного реактива глутарового альдегида. Технической задачей изобретения является усовершенствование способа получения конъюгированного антигена стрептомицинбелковый носитель, которая достигается за счет активации компонентов глутаровым альдегидом. Процедура получения препарата Стрептомицин (34 мг) и БСА (68 мг) растворяли в 10 мл раствора этанол/фосфатно-солевой буфер(50/50). Добавляли 100 мкл 25 раствора глутарового альдегида и перемешивали при комнатной температуре. Через 3 часа полученный конъюгат стрептомицин-БСА диализовали против 5 л фосфатно-солевого буфера (рН 7,2) с трехкратной сменой буфера. Использование конъюгата стрептомицин-БСА приведены в следующих примерах. Пример 1. Полученные конъюгаты вводили кроликам в объеме 0,5 мл в 0,5 мл полного адьюванта Фрейнда(перемешивали до получения однородной массы) 4-х кратно подкожно в область спины в несколько точек с интервалом 7 суток. Через 5 дней после последнего введения антигена проводили взятие крови с целью тестирования сывороток методом иммуноферментного анализа. Пример 2. Ячейки 96-луночного планшета для иммунологических реакций(,Дания) сенсибилизировали гетерологичным конъюгатом стрептомицин-овальбумин (молекулярная масса 45 кД) в концентрации 0,005 мг/мл, при 4 С в течение ночи. Для удаления несвязавшегося антигена планшет отмывали 3 раза фосфатно-солевым буфером с содержанием 0,05 твина-20 (ФСБ-ТВ). После этого вносили иммунную сыворотку крови в количестве 0,1 мл в разведениях и инкубировали при 37 С в течение 60 минут. Далее планшет отмывали описанным способом для удаления неспецифически связавшихся антител. Затем в лунки планшет вносили кроличьи антитела, меченные пероксидазой хрена (антивидовой коньюгат) в объеме 0,1 мл и инкубировали при 37 С в течение 1 часа. Повторяли процедуру отмывки для удаления несвязанных продуктов реакции и в лунки вносили по 0,1 мл раствора субстрата фермента. Субстрат готовили непосредственно перед использованием путем растворения 0,01 г ортофенилендиамина (ОФД)(, США) в 10 мл 1 раствора лимонной кислоты с рН 4,5 и добавлением 0,005 мл 30 перекиси водорода. Планшет инкубировали 10-15 минут при комнатной температуре. Положительная реакция характеризуется окрашиванием раствора субстрата в желто-коричневый цвет. Реакцию останавливали добавлением в лунки планшет раствора 0,5 М серной кислоты. Результаты ИФА учитывали с помощью спектрофотометра с вертикальным потоком света (96,Австрия) при длине волны 492 нм. Таким образом, тестирование полученного конъюгата стрептомицин-БСА показало его специфичность и сероактивность в иммуноферментном анализе. В результате были определены параметры конъюгации антибиотика стрептомицина и бычьего сывороточного альбумина (БСА) с применением глутарового альдегида. Полученный препарат может найти применение как иммуноген при получении специфических антигенным детерминантам стрептомицина препаратов. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения конъюгата стрептомицина с бычьим сывороточным альбумином, включающий предварительное растворение реагентов в смеси этанол/фосфатно-солевой буфер, отличающийся тем, что в качестве сшивающего агента используют глутаровый альдегид.