Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus Musculus L., – продуцент моноклональных антител к рекомбинантному антигену р24 вируса лейкоза крупного рогатого скота

(51) 01 33/577 (2010.01) 61 39/395 (2010.01) 12 5/07 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ рекомбинантному антигену р 24 ВЛКРС получали гибридизацией иммунных лимфоцитов мыши линии/ с клетками миеломной линии Х 638.653 по методу Келера и Мильштейна, (1976). Изучение иммунохимических свойств моноклональных антител проводили с использованием иммуноферментного анализа, иммуноблота и электрофореза в полиакриламидном геле. Штамм гибридных культивируемых клеток животных., -продуцирует однородный по составу гомогенные препараты антител,которые реагируют только с рекомбинантным антигеном р 24 ВЛКРС. Концентрация антител - 25 мкг/мл в культуральной среде. Концентрация моноклональных антител по белку очищенных из асцитной жидкости 4-8 мг/мл. Титр иммуноглобулинов в культуральной среде - 1128, а в асцитной жидкости титр антител достигает 151200. Все полученные моноклональные антитела относятся к классу , подклассу 1. Константа связывания (аффинность) моноклональных антител составляет 2109 М-1.(72) Бакирова Гульнар Аманжоловна Белялова Айжан Рахимкановна Жылкибаев Асылбек Айтанович Балтин Кайрат Канатович Муканов Касым Касенович Мукантаев Канатбек Найзабекович Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан Комитет науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ.,ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К РЕКОМБИНАНТНОМУ АНТИГЕНУ Р 24 ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в ветеринарии при диагностике лейкоза крупного рогатого скота. Штамм гибридных культивируемых клеток продуцирующих моноклональные антитела к Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в ветеринарии при диагностике лейкоза крупного рогатого скота. Лейкоз крупного рогатого скота (ЛКРС) хроническая инфекционная болезнь опухолевой природы, в большинстве случаев протекает бессимптомно, примерно у 30 зараженных животных в течение 3 лет проявляется персистентным лимфоцитозом,образованием опухолей в кроветворных и других органах и тканях. Зараженных животных можно выявить прямым и косвенным методом. Последний основан на выявление антител к вирусу в реакции иммунодиффузии(РИД),иммуноферментным методом (ИФА, ). Золотым стандартом при диагностике инфекционных болезней является метод прямого выявления возбудителя. Однако данный метод выявления вируса многозатратен,требует специальной подготовки и не осуществим при массовых исследованиях. В связи с этим, остро встает вопрос о необходимости разработки высокочувствительных методов диагностики, основанных на современных достижениях биотехнологии и внедрения отечественных технологий по их производству. Известен штамм 8 С 12 межвидовых гибридных клеток миеломы мыши РЗ- 638. 653 со спленоцитами овцы к гликопротеидному антигену вируса лейкоза крупного рогатого скота. Штамм является постоянной гибридной линией клеток и обладает высоким уровнем продукции моноклональных антител овцы. Титры антител в нативной культуральной жидкости составляют 132164 в иммуноферментном анализе (ИФА). Моноклональные антитела специфичны к общей антигенной детерминанте гликопротеидов вируса лейкоза КРС - наружного 51 и трансмембранного 30. При использовании в ИФА для выявления антител в сыворотке крови и молоке инфицированного вирусом лейкоза КРС моноклональные антитела обеспечивают прочное избирательное связывание с твердофазным носителем и оптимальную пространственную ориентацию гликопротеидного антигена //А 2377297 125/18, 2009). Известен штамм межвидовой гибридомной культуры клеток, продуцирующей антитела к гликопротеидному антигену вируса лейкоза крупного рогатого скота ВМА/сс-1, полученный при слиянии лимфоцитов периферической крови теленка голштинской породы,гипериммунизированного инактивированным антигеном вируса лейкоза крупного рогатого скота(ВЛКРС) с клетками мышиной миеломы 2/0-4. Штамм обладает высокой продукцией моноклональных антител крупного рогатого скота подкласса , специфичных к гликопротеидному антигену ВЛКРС в ИФА. При изучении в вестернблот-анализе выявлена иммунореактивность моноклональных антител против вирусного антигена, который представляет собой гликопротеид с мол. массой 69 Кд. //Журнал. . . . . 1988, -. 50, -. 1136-1138). 2 Задачей изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток,продуцирующего моноклональные антитела к рекомбинантному антигену р 24 вирусу лейкоза крупного рогатого скота. Штамм получают следующим образом. Мышам линии / в первый день иммунизации внутрибрюшинно вводят 100 мкг рекомбинантного антигена р 24 вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), в 0,1 мл полного адьюванта Фрейнда и 0,5 мл забуференном физиологическом растворе (ЗФР),7,2-7,4. Смесь взбивают до образования творожистой массы. На 7,11, 12, 13-й дни иммунизации животным инъецируют по 100 мкг антигена в ЗФР,7,2-7,4. Спустя 3 дня после последней иммунизации спленоциты мышей, которые дают более высокие титры антител по ИФА используют для гибридизации. Гибридизацию проводят добавлением 1-го мл раствора, содержащего 45 полиэтиленгликоля 4000 и 10 диметилсульфоксид и 45 -1640 к смеси состоящего из 4106 клеток -63.-8 5.6.3. и 20106 спленоцитов в течение 1 минуты. После гибридизации и отмывки клеток от полиэтиленгликоля их высевают в ячейки 96-луночной панели. На следующий день в эти лунки вносят среду с гипоксантином,аминоптерином и тимидином (ГАТТ). Через 10-14 дней после слияния в лунках, имеющих колонии клеток размером 2-3 мм, отбирают культуральную среду для определения продуктивности гибридных клеток. Тестирование проводят методом твердофазного ИФА с использованием рекомбинантного антигена р 24 ВЛКРС и кроличьих иммуноглобулинов к антителам мыши, меченых пероксидазой хрена. В течение 21 дня после слияния, клетки находятся в среде ГАТТ. Затем постепенно клетки переводят на среду гипоксантинтимидин (ГТ) и полную среду -1640. Клоны клеток, продуцирующих моноклональные антитела,трижды клонируют методом лимитирующих разведений. После третьего клонирования 60 субклонов продуцируют антитела к тестируемому антигену. Штамм гибридных клеток продуцирует антитела в культуральную среду. Продуктивный клон гибридомы обозначают/ВЛКРС - 22. Штамм гибридных клеток/ВЛКРС - 22 депонирован и хранится в РГП Республиканская коллекция микроорганизмов (010000, г. Астана, ул. Ш. Валиханова, 13/1) под регистрационным номером 0363 и характеризуется следующими свойствами. Морфологическая характеристика. Гибридные клетки представляют собой слабо прикрепляющиеся к носителю округлые клетки размером с исходную миеломную клетку. Ядро занимает большую часть клетки. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка. Культуральные свойства. Гибридные клетки выращивают в среде -1640, содержащую инактивированную нагреванием сыворотку эмбриона коров (10-20) 20 мл/л 200 мМглютамина- 3,375 г/л 2-меркаптоэтанола - 3 мкл/л 10 мл/л пирувата натрия бикарбоната натрия- 3,7 г/л. Клетки культивируют при 37 в атмосфере 5 С 2. Характер роста - стационарная суспензия. Посевная концентрация 2105 клеток в 1 мл. Частота пассирования через 3-4 суток. При внутрибрюшинном введении сингенным мышам штамм гибридомы образует опухоль в асцитной форме на 14 - 16 день. Доза клеток при прививке 2105 клеток. За 14 дней до введения гибридомы мышам вводят внутрибрюшинно 2,6,10,14 тетраметилпентадекан в дозе 0,5 мл на голову. Штамм сохраняет способность продуцировать специфические моноклональные антитела в течение 4 пассажей на сингенных мышах (время наблюдения). Продуктивность штамма. На 8 день культивирования гибридомы, концентрация антител достигает 25 мкг/ мл в культуральной среде. Концентрация моноклональных антител по белку очищенных из асцитной жидкости составляет 4-8 мг/мл. Титр иммуноглобулинов в культуральной среде 1128, а в асцитной жидкости титр антител достигает до 151 200. Характеристика полезного продукта. Синтезируемые штаммом гибридомы моноклональные антитела относятся к классу ,подклассу 1. Константа связывания(аффинность) моноклональных антител составляет 2 х 109 М-1. Методы оценки специфичности МКА иммуноблотинг, непрямой и сэндвич варианты ИФА. Контаминация. Контаминантов в клетках включая, бактерии, грибы, дрожжи и микоплазмы не обнаружено. Криоконсервация. К осадку гибридных клеток добавляют эмбриональную сыворотку коров, и затем диметилсульфоксид до конечной концентрации 10. Суспензию клеток разливают в стерильные пластиковые ампулы с завинчивающимися крышками по 2105 клеток в объеме 1 мл. Ампулы помещают в коробку из пенопласта и оставляют на сутки при -70, а затем переносят в жидкий азот. Условия размораживания. Замороженную ампулу быстро помещают в водяную баню при 37 С. После размораживания суспензию клеток переносят стерильно в пробирку, содержащую 10 мл холодной бессывороточной среды -1640,отмывают один раз и засевают в ячейки 24 луночной планшеты с питающим слоем перитонеальных макрофагов. Число жизнеспособных клеток после размораживания не менее 60. Штамм гибридных культивируемых клеток/Л-22 используют следующим образом. Пример 1. Гибридные клетки высевают в пластиковые матрасы площадью по клеток в мл питательной среды и инкубируют 3 дня при 37 в атмосфере 5 СО 2. Суспензию клеток с культуральной средой собирают и центрифугируют 10 минут при 800 с целью отделения клеток от 3 надосадочной жидкости, содержащей антитела. При культивировании гибридомы на мышах,иммуноглобулины из асцитной жидкости получают методом высаливания сульфатом аммония до 50 насыщения. Для этого в асцитную жидкость добавляют равный объем 0,15 М фосфатнобуферного раствора (ФБР), -7,2. Затем добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и оставляют при перемешивании на ночь при 4. Иммуноглобулины отделяются центрифугированием при 5000 об/мин, в течение 30 минут, при 4. Осадок антител ресуспендируют в минимальном объеме ФБР. Пример 2. Для проведения непрямого ИФА на 96-луночную планшету для иммунологических реакций сорбируют раститрованный рекомбинантный антиген р 24 ВЛКРС. Раститровку проводят с 10 мкг/мл до 1 нг/мл и вносят по 100 мкл в лунку в 0,05 М трис ,7,2-7,4. Планшет инкубируют при 4 в течение ночи. Затем планшет отмывают 3 раза в 0,005 М трис ,7,2-7,4 с 0,05-ным твином-20 и 3 раза в 0,005 М трис , 7,2-7,4. В лунки планшеты вносят по 100 мкл 10 раствора фетальной сыворотки телят для забивки свободной поверхности лунки и инкубируют в течение 1 часа при 37. После инкубирования повторяют процедуру отмывки. На раститрованный антиген вносят разведения моноклональных антител с 1100 до 16000 в объеме 100 мкл в 0,05 М трис , содержащий 10 фетальной сыворотки телят и 0,05 Твин-20. После инкубации в течение 1 часа при 37 планшету отмывают описанным способом и вносят в ячейки антитела кролика против иммуноглобулинов мыши,меченные пероксидазой. Через 1 ч повторяют процедуру отмывки с целью удаления несвязанных продуктов реакции. Антитела против рекомбинантного антигена р 24 ВЛКРС определяют количественно по расщеплению субстрата, который готовят разведением 10 мг ортофенилендиамина в 10 мл лимонной кислоты, Н - 4,5 с добавлением 50 мкл 3 раствора перекиси водорода. Положительная реакция характеризуется коричневым окрашиванием и просчитывается при 492 нм. Рабочее разведение моноклональных антител 1500. Пример 3. Образцы рекомбинантного антигена р 24 ВЛКРС в количестве 10 мкг подвергают электрофорезу в 7-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Электрофореграмму переносят на нитроцеллюлозную мембрану в течение 2 часов при силе тока 60 В и 250 мА. Свободные участки носителя блокируют 1-ным бычьим сывороточным альбумином в ЗФР,7,2-7.4 (18 ч при 4 или 2 ч при 37), затем отмывают по 3 раза ЗФР и инкубируют 1,5 ч при 37 с МКА из очищенной асцитной жидкости, разведенной 1100 ЗФР-Тв. После этого носитель отмывают 3 раза ЗФР-Тв и ЗФР, затем его выдерживают в рабочем разведении антимышиных антител, меченных пероксидазой (1 ч при 37). Повторяют процедуру отмывки и проявляют реакцию с помощью 4-хлор-1 нафтола. Иммунохимическое проявление фракций белков в иммуноблотинге с применением моноклональных антител и антимышиных антител, меченных пероксидазой хрена, показало специфичность моноклональных антител к эпитопам белка,молекулярная масса которого соответствовала 24 кД. Полученные данные свидетельствуют о возможности использования МКА штамма гибридомы Ма/ВЛКРС-2 Р 2 в качестве реагента при разработке методов крупного рогатого скота. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм гибридных культивируемых клеток животных. /ВЛКРС-22,депонированный в РГП Республиканская коллекция микроорганизмов, под номером -0363, продуцирующий моноклональные антитела к рекомбинантному антигену 24 вируса лейкоза крупного рогатого скота.