Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus Mab/2F9-p24,используемый для получения моноклональных антител к полипептидному антигену р24 вируса лейкоза крупного рогатого скота

(51) 12 5/20 (2011.01) 01 33/577 (2011.01) 12 21/08 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ПОЛИПЕПТИДНОМУ АНТИГЕНУ Р 24 ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в разработке тестов для диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС). Технической задачей изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующего МКА к полипептидному антигену р 24. Полученный штамм обозначают /29-24,который хранится в ДГП Республиканская коллекция микроорганизмов РГП Национальный центр биотехнологии МОН РК под номером 0277. Моноклональные антитела могут быть использованы в качестве основных реагентов диагностической тест-системы для серологической диагностики ВЛКРС.(72) Боровиков Сергей Николаевич Сураншиев Жанболат Амреевич Булашев Айтбай Кабыкешович Киян Владимир Сергеевич Куйбагаров Марат Амангельдыевич(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в разработке тестов для диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС). В настоящее время при диагностике лейкоза крупного рогатого скота (ЛКРС) все большее значение приобретают высокочувствительные иммунологические тесты диагностики, такие как иммуноферментный анализ(Гулюкин М.И., Нахмансон В.М., Дун Е.А. Серологический метод диагностики в системе противолейкозных мероприятий. // Ветеринария,7.- 1997 - с .12-14.). Согласно международным стандартам, при обследованиях животных для выявления вируса лейкоза (в частности, при проверке на лейкоз при международных торговых операциях) используются реакция иммунодиффузии.., 141991.). Способы диагностики лейкоза КРС основанные на ИФА, имеют большую перспективу в части внедрения в практику. Однако, недостатком иммуноферментных способов диагностики является использование в них поликлональных антител, что снижает их специфичность, чувствительность и является главным препятствием при внедрении в диагностическую практику. Поэтому ИФА как диагностический тест будет иметь ценность лишь в том случае, когда в нем будут использованы в качестве основного реагента способа моноклональные антитела (МКА), позволяющие качественно повысить специфичность анализа,характеризующиеся постоянными свойствами, т.е. имеющие моноклональное происхождение и доступные в неограниченном количестве. Наиболее близкими к предлагаемому изобретению прототипом являются поликлональные антитела успешно примененные в диагностике лейкоза крупного рогатого скота ( , .. , . . .. 77 (2) 166-8 16335252 (, , , , ).смотря на хорошие результаты, был отмечен высокий процент перекрестных реакций и как следствие,ложноположительных результатов. Технической задачей изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующих моноклональные антитела к полипептидному антигену р 24 вируса лейкоза крупного рогатого скота. Полученный штамм обозначают /29-24,который хранится в ДГП Республиканская коллекция микроорганизмов РГП Национальный центр биотехнологии МОН РК под номером 0277. 2 Мышам линии / в первый день иммунизации внутрибрюшинно вводят 100 мкг очищенного рекомбинантного антигена р 24 в 0,1 мл неполного адъюванта Фрейнда. На 7, 11, 12, 13-й дни иммунизации животным инъецируют по 100 мкг этого же антигена в забуференном физиологическом растворе (ЗФР), рН 7,2-7,4. Спустя 4 дня после последней иммунизации извлекают селезенку мышей, которые имеют высокие титры антител в сыворотке крови по результатам твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА). Клетки селезенки (В-лимфоциты) иммунных мышей в количестве 1107 гибридизируют с клетками миеломы 63-8-563 (1106) в 1 мл неполной питательной среды,содержащей 45 полиэтиленгликоль с молекулярной массой 4000 и 10 диметилсульфоксид. После гибридизации и отмывки клеток от полиэтиленгликоля их высевают в ячейки 96-луночной панели на слой перитонеальных макрофагов мыши. На следующий день в эти лунки вносят селективную питательную среду, содержащую гипоксантин-аминоптеринтимидин (Г). Через 10-14 дней после слияния из лунок, имеющих колонии клеток размером 2-3 мм,отбирают культуральную среду, содержащую антитела для определения продуктивности гибридных клеток. Тестирование проводят методом ТИФА с использованием полипептидного антигена р 24 икроличьих иммуноглобулинов к антителам мыши, меченных пероксидазой хрена. В течение 21 дня после слияния, гибридные клетки культивируют на среде с ГАТ и затем постепенно переводят на среду, содержащую гипоксантин-тимидин (ГТ) и полную среду -1640. Клоны гибридных клеток,продуцирующих МКА к полипептидному антигену р 24, дважды клонируют методом лимитирующих разведений. После второго клонирования 95 субклонов должны продуцировать антитела к тестируемому антигену. Продуктивный клон гибридомы, обозначенный как/29-24 депонирован в ДГП Республиканская коллекция микроорганизмов РГП Национальный центр биотехнологии МОН РК (010000, г. Астана, ул. Ш. Уалиханова, 13/1) под регистрационным номером-0277 и характеризуется следующими признаками. Морфологические признаки. Гибридные клетки представляют собой слабо прикрепляющиеся к носителю округлые клетки размером с исходную миеломную клетку. Ядро занимает большую часть клетки. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка. Культуральные признаки. Гибридные клетки адаптированы к росту в среде-1640,содержащую инактивированную нагреванием сыворотку эмбриона коров (10-20) 20 мл/л 200 мМ-глютамина- 3,375 г/л 2-меркаптоэтанола 0,003 мл/л 10 мл/л пирувата натрия бикарбоната натрия -3,7 г/л. Клетки культивируют в пластиковых матрацах при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Характер роста - стационарная суспензия. Посевная концентрация 2106 клеток в 1 мл. Рост клеток ведут до достижения плотности монослоя в пределах 75 24943 80 или концентрации клеток не выше 0,5106 в 1 мл. Частота пассирования 3-4 суток. Продуктивность штамма. На 3-4-й день культивирования гибридомы концентрация МКА составляет 0,035-0,040 мг/мл в культуральной среде и 4-8 мг/мл в очищенной асцитной жидкости. Титры иммуноглобулинов культуральной среды по отношению к исходному антигену составляют в ТИФА-1256, в асцитной жидкости 151200. Характеристика полезного продукта. МКА относятся к иммуно глобулинам класса , подкласса 3. Константа связывания 1 х 10-9 М. Способы оценки специфичности МКА ТИФА. Контаминация. Контаминация бактериями,грибами и микоплазмами не обнаружена. Криоконсервирование. Гибридные клетки снимают с матраца мягким пипетированием и переносят в отдельные центрифужные пробирки. Осаждают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 6-8 мин. К осадку гибридных клеток добавляют сыворотку плода коровы (0,9 мл), а затем диметилсульфоксид до конечной концентрации 10. Суспензию гибридных клеток разливают в стерильные пластиковые ампулы с завинчивающими крышками по 1 мл (1-5 х 106 кл.),помещают в коробку из пенопласта и переносят в низкотемпературный холодильник при -70 С на 1618 часов. Затем ампулы с гибридными клетками переносят в контейнеры с жидким азотом (-196 С). Условия размораживания. Ампулу с гибридными клетками вынимают из сосуда с жидким азотом и помещают в водяную баню, нагретую до 37 С. Как только растают кусочки льда, суспензию гибридных клеток переносят в отдельную стерильную центрифужную пробирку, содержащую 10 мл холодной неполной ростовой среды, отмывают один раз путем центрифугирования в течение 6-8 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют,осадок клеток ресуспендируют в полной ростовой среде, нагретой до комнатной температуры, и высевают в ячейки 24-луночного планшета с питающим слоем перитонеальных макрофагов. Штамм гибридомы М /29-24 используют следующим образом. Пример 1. Гибридные клетки высевают в пластиковые матрацы площадью 25 см 3 по 5105 клеток в 5 мл ростовой среды и инкубируют 3-4 дня при 37 С в атмосфере 5 СО 2. Культуральную среду собирают и центрифугируют 10 минут при 1000 об/мин с целью отделения клеток от надосадочной жидкости, содержащей антитела. Для наработки препаративного количества МКА осадок гибридных клеток разводят неполной ростовой средой в объеме 0,5 мл и вводят внутрибрюшинно (в концентрации 1-2 млн. клеток) мышам линии/, которым предварительно инъецировали пристан пентадексан). Через 10-14 дней после прививки гибридных клеток мышей забивают путем цервикальной дислокации, стерильным шприцом отсасывают асцитную жидкость, вводя иглу в брюшную полость. Асцитную жидкость собирают в центрифужные пробирки и очищают от гибридных клеток центрифугированием в течение 6-8 мин при 1000 об/мин. Очистку МКА осуществляют методом высаливания насыщенным раствором сульфата аммония. Специфичность определяют в ТИФА с использованием рекомбинантного антигена р 24. Для проведения ТИФА на 96-луночный полистироловый планшет сорбируют антиген в концентрации 10 мкг/мл в 100 мкл ЗФР, рН 7,2-7,4. Инкубируют при 4 С в течение ночи или 2 часа при 37 С. Затем планшет отмывают 3 раза ЗФР с 0,05 ным твином-20 (ЗФР-Тв) и 3 раза ЗФР. В лунках вертикальных рядов планшета готовят двукратные разведения исследуемой культуральной жидкости(КЖ) или асцитной жидкости (АЖ) начиная с разведения 1100 и выше в 0,1 мл ЗФР-Тв. Одновременно ставят контроли с культуральной жидкостью миеломных клеток в тех же разведениях и с ЗФР-Тв. Затем планшет накрывают крышкой и инкубируют в термостате при 37 С в течении 1 часа. После инкубации содержимое лунок удаляют,повторяют процедуру отмывки планшета и в каждую лунку вносят по 0,1 мл рабочего разведения конъюгата(антитела кролика против иммуноглобулинов мыши, меченные пероксидазой) в ЗФР-Тв. Через 1 час после инкубации при 37 С повторяют процедуру отмывки планшета и в каждую лунку вносят по 0,1 мл свежеприготовленной субстратной смеси (5 мг ортофенилендиамина растворяют в 10 мл 0,05 М цитратно-фосфатного буфера, рН 4,5 и добавляют 0,025 мл 3-ного перекиси водорода). Затем планшет накрывают крышкой и оставляют в темном месте при комнатной температуре. Через 10-15 мин экспозиции реакцию останавливают путем внесения в каждую лунку по 0,1 мл 0,5 М раствора 2 О 4. Результаты реакции учитывают на спектрофотометре путем измерения оптической плотности жидкости в каждой лунке при длине волны 492 нм. Положительная реакция характеризуется появлением в лунках темнокоричневого окрашивания, при отрицательной содержимое лунок остается бесцветным или имеет светло-желтое окрашивание. Титром моноклональных антител считают их максимальное разведение, величина оптической плотности в котором в 2 и более раза превосходит оптическую плотность в лунках с отрицательным контролем. Результаты опыта по определению специфичности МКА в ТИФА представлены в таблице 1. Титры МКА Культуральная жидкость 1256 132 РО РО РО РО Растворимые антигены 1 Рекомбинантный антиген р 24 2 Культуральный антиген 51 24 3 Вирус гриппа птиц типа А штамм 51 4 Вирус болезни Ауэски 5 Вирус болезни Ньюкасла 6 Вирус классической чумы свиней Примечание - РО - реакция отрицательная. Как видно из приведенных в таблице 1 результатов, полученные моноклональные антитела проявляют высокую активность к полипептидному антигену р 24 ВЛКРС и слабо реагируют с антигенами других видов вирусов. Таким образом,результаты опыта свидетельствуют о специфичности МКА гибридомы/29-24 к антигену р 24 ВЛКРС, что позволяет получать на их основе эффективные диагностические препараты для диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Пример 2. На 96-луночный планшет для иммунологических реакций (, Дания) в течение ночи при 4 С сорбируют МКА штамма /29-24 в виде культуральной жидкости. Затем панель отмывают по три раза ЗФР-Тв и ЗФР и вносят в ячейки полипептидный антиген р 24 ВЛКРС. После инкубации при 37 С в течение 1 часа, панель отмывают описанным способом, готовят в ячейках разведения исследуемой сыворотки крови крупного рогатого скота и контроли. После выдерживания панели при 37 С в течение 1,5 ч повторяют процедуру отмывки и в ячейки вносят антитела противКРС (антивидовой коньюгат), меченные пероксидазой хрена. Субстрат готовят непосредственно перед использованием путем растворения 0,01 г ортофенилендиамина (ОФД)(, США) в 10 мл 1 раствора лимонной кислоты с рН 4,5 и добавлением 0,005 мл 30 перекиси водорода. Планшет инкубируют 10-15 минут при комнатной температуре. Положительная реакция характеризуется окрашиванием раствора субстрата в желто-коричневый цвет. Реакцию останавливают добавлением в лунки планшет раствора 0,5 М серной кислоты. Результаты ИФА учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным потоком света при длине волны 492 нм. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм гибридных культивируемых клеток животных/29-24,депонированный в ДГП Республиканская коллекция микроорганизмов РГП Национальный центр биотехнологии КН МОН РК,0277, продуцирующий моноклональные антитела к полипептидному антигену р 24 вируса лейкоза крупного рогатого скота.