Способ приготовления экскреторно-секреторного антигена для серологической диагностики описторхоза

(51) 01 33/53 (2010.01) 61 10/00 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ОПИСТОРХОЗА(57) Изобретение относится к ветеринарии, а именно к диагностике инфекционных болезней животных. Технической задачей изобретения является усовершенствование способа получения экскреторно-секреторного антигена для серологической диагностики описторхоза животных,которая достигается путем культивирования гельминтовв неполной синтетической среде Игла с последующей очисткой и концентрацией культуральной жидкости. В результате были определены параметры получения, очистки и использования экскреторносекреторного антигена для серологической диагностики описторхоза животных.(72) Булашев Айтбай Кабыкешович Боровиков Сергей Николаевич Куйбагаров Марат Амангельдыевич Сураншиев Жанболат Амреевич Лидер Людмила Александровна Баешева Динагуль Аяпбековна Атыгаева Сауле Кабиевна Серикова Шынар Халикова Альфия Сафиоллаевна Сутула Максим Юрьевич(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина 23891 Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в иммунологических тестах для серологической диагностики описторхоза животных и человека. Диагностика описторхоза по клинической картине заболевания трудна из-за отсутствия симптомов и синдромов, характерных только для данной болезни. Для точной диагностики,качественной и количественной оценки заболевания необходим комплексный подход с использованием различных методов. Клинические проявления описторхоза многообразны и зависят как от длительности и интенсивности инвазии, так и от индивидуальных особенностей организма. Поэтому диагностика этого гельминтоза должна строиться с учетом эпидемиологического анамнеза и установления факта употребления обследуемым в пищу потенциально зараженной рыбы. Для дифференциальной диагностики описторхоза от заболеваний печени и желчевыводящих путей другой этиологии используют рентгенологическое и ультразвуковое исследования (Карбышева Иммунный ответ у больных хроническим описторхозом, Консилиум. -2001. - 6. . 15-18). Первоначально применявшиеся в серологической диагностике описторхоза реакция иммунодиффузии в геле и реакция непрямой гемагглютинации зарекомендовали себя недостаточно чувствительными, особенно при хронических стадиях заболевания. Кроме того, в данных методах используется визуальная(субъективная) оценка результата анализа, они не поддаются автоматизации и неудобны для проведения одновременно большого числа анализов(Гиновкер И.А., Забозлаева Е.А., Доронин А.В. Реакция преципитации в геле как диагностический тест в ранней фазе описторхоза. Мед. паразитология, 1970, 4, с. 402.). Диагностика описторхоза у животных в основном проводиться по результатам копрологических исследований (наличие яиц гельминтов). Имеются данные по исследованиям в области серологической диагностики,но коммерческих тест-систем не разработаны(Менявцева Т.А., Ратнер Г.М., Колмакова М.В. С соавт. Диагностика острого и хронического описторхоза методом твердофазного ИФА. Сибирский журнал гастроэнтерологии и гепатологии, 1995,1, с. 48.). Несмотря довольно широкий перечень существующих способов серологической диагностики описторхоза специфичность их оставляет желать лучшего. Основной причиной является невысокая специфичность используемых антигенов и как следствие высокий процент ложноположительных случаев. В связи с этим остро стоит вопрос поиска новых способов получения специфических антигенов описторхов, основанных на современных технологиях использования уникальных реагентов. Получение достаточного количества эффективного антигенного материала описторхов почти всегда сопряжено с определенными трудностями,обусловленными сложностью биологического цикла паразита, необходимостью заражения большого количества лабораторных животных. В последнее время в гельминтологии появились иммунодиагностические средства,разработанные на основе использования экскреторно-секреторных антигенов гельминтов 2008). По своим диагностическим качествам они не уступают антигенам гельминтов, полученных другими способами. При этом можно довольствоваться незначительным количеством исходного материала, что является немаловажным обстоятельством, особенно при описторхозах. Наиболее близкой к предлагаемому изобретению(прототипом) является разработка ученых медицинского факультета УниверситетКаеп (Тайланд). Ими описывается способ получения экскреторно-секреторного антигена гельминтовпутем культивирования марит(половозрелых гельминтов) в модифицированном фосфатно-солевом буфере. В результате проведенных исследований учеными получен экскреторно-секреторный антиген активный в иммуноферментном анализе (, . 22,3, . 139-145).смотря на хорошие результаты полученные посредством описанного способа, выживаемость описторхов в использованном в качестве среды культивирования буферном растворе была не высока (не более 24 часов). Предлагаемый способ получения экскреторносекреторного антигена описторхов предполагает использование неполной синтетической среды Игла,которая позволяет увеличить период культивирования до 72-96 часов и как следствие значительно повысить концентрацию искомого продукта в среде. Технической задачей изобретения является устранение отмеченных недостатков и усовершенствования способа получения экскреторно-секреторного антигена для серологической диагностики описторхоза человека и животных. В результате были определены параметры культивирования марит описторхов, получения и очистки продуцируемого ими экскреторносекреторного антигена. Получение метацеркариев Рыбу семейства карповых (язь, лещ) исследовали на наличие метацеркариев описторхов. Для этого делали срез мышц толщиной 2-4 мм. В зависимости от величины среза его либо весь помещали в компрессорий, либо просматривали его по частям. В качестве компрессория использовали стандартный,применяющийся в ветеринарии для трихинеллоскопии аппарат, или стекла размером 2 23891 6-812-15 см. Мышцы рыбы, сдавленной между стеклами, микроскопировали при увеличении 16-20 раз. Если срез просматривали с одной стороны,полученные результаты удваивали. Получение половозрелых описторхов Всю подкожную мышечную ткань рыб содержащую метацеркарии отделяли от кожи и костей и использовали для заражения лабораторных животных (собак) путем вольного скармливания. Через 8-9 недель отпрепарировали желчный пузырь,выкладывали в чашку Петри, вскрывали, заливали физиологическим раствором, в котором промывали его оболочку. Делали соскоб со стенок желчного пузыря и наносили на предметное стекло. С помощью лупы исследовали разведенную желчь на наличие паразитов. Печень просматривали снаружи,после чего измельчали паренхиму и проводили многоэтапную отмывку водой до появления прозрачной надосадочной жидкости. Осадок мелкими партиями просматривали под лупой. Гельминтов отмывали стерильным физиологическим раствором содержащим антибиотики (2000 ЕД/мл пенициллина и 1 мг/мл стрептомицина). Жизнеспособность марит определяли по наличию движения. Культивирование описторхов Отмытые описторхи в количестве 20-30 штук в 10 мл неполной среды Игла с антибиотиками (1000 ЕД/мл пенициллина и 1 мг/мл стрептомицина) переносили в стерильные полистироловые матрацы объемом 50 мл (, Дания). Культивирование проводили при 37 С и содержании С 2 - 5. Отбор культуральной жидкости проводили через 72 и 96 часов. Для этого культуральную жидкость сливали с матраца в стерильные полипропиленовые пробирки объемом 10 мл и центрифугировали при 10000 об/мин - 10 мин. Супернатант, содержащий экскреторно-секреторный антиген фильтровали через мебранный фильтр (0,45 мкм) и диализовали против дистиллированной воды с помощью диализных трубок с размером пор 10 кД при температуре 4 С в течение 24 часов. Использование экскреторно-секреторного антигена описторхов приведены в следующих примерах. Пример 1. Для постановки непрямого варианта иммуноферментного анализа (ИФА) ячейки 96 луночного планшета для иммунологических реакций сенсибилизировали экскреторносекреторным антигеном в концентрации 0,010 мг/мл) 0,05 М карбонат-бикарбонатном буфере рН 9,6, при 4 С в течение ночи. Для удаления несвязавшегося антигена планшет отмывали 3 раза фосфатно-солевым буфером содержащим 0,5 твина-20 (ФСБ-ТВ). После этого вносили антителосодержащую жидкость в разведениях в количестве 0,1 мл и инкубировали при 37 С в течение 60 минут. После инкубирования планшет отмывали описанным способом для удаления неспецифически связавшихся антител. Затем в лунки планшет вносили антивидовой коньюгат в объеме 0,1 мл иинкубировали при 37 в течение 1 часа. Повторяли процедуру отмывки для удаления несвязанных продуктов реакции и в лунки вносили по 0,1 мл раствора субстрата фермента (3,3, 5,5, ). Планшет инкубировали 10-15 минут при комнатной температуре. Положительная реакция характеризуется окрашиванием раствора субстрата в синий цвет. Реакцию останавливали добавлением в лунки планшет раствора 0,5 М раствора серной кислоты. Результаты ИФА учитывали с помощью спектрофотометра с вертикальным потоком света( 96, Австрия) при длине волны 450 нм. Для исследования использовали пробы сыворотки крови от собак зараженных описторхозом. В качестве отрицательного контроля использовали пробы сыворотки крови здоровых собак. Всего было исследовано 9 проб сывороток крови. Пример 2. Постановка иммуноблотинга предусматривала следующие этапы 1) проведение электрофореза 2) перенос электрофореаграммы на нитроцеллюлозную мембрану 3) иммунохимическое проявление нитроцеллюлозных реплик. Электрофоретический перенос антигенов из геля на нитроцеллюлозную мембрану осуществляли с помощью прибора для иммуноблотинга (, Англия). Для этого готовили следующие растворы катодный буфер -0,3 г Трис и 0,5 г аминогенной кислоты растворяли в 20 мл метанола и доводили объем до 100 мл дистиллированной водой анодный буфер 1 - 3,6 г Трис растворяли в 20 мл метанола и доводили объем до 100 мл дистиллированной водой анодный буфер 2 - 0,3 г Трис растворяли в 20 мл метанола и доводили объем до 100 мл дистиллированной водой. Прибор готовили к работе следующим образом на графитовую пластину помещали фильтровальную бумагу (, США) смоченную в анодном буфере 1, затем -смоченную в анодном буфере 2, накрывали нитроцеллюлозной мембраной(,Ш) и укладывали на мембрану полиакриламидный гель,накрывали его фильтровальной бумагой, смоченной, в катодном буфере и закрывали, прибор. Перенос проводили при постоянной силе тока 0,8 мА/см геля в течение одного часа. Для иммунохимического проявления специфических антигенов нитроцеллюлозную мембрану сначала инкубировали в 1 растворе бычьего сывороточного альбумина (БСА) в течение ночи при 4 С. Затем отмывали по три раза фосфатно-солевым буфером содержащим 0,05 твина-20 (ФСБ-Тв) и выдерживали 1,5 ч при 37 С в растворе исследуемой сыворотки крови разведенной 1100 в ФСБ-Тв. После чего носитель вновь отмывали и инкубировали в рабочем разведении антивидовых антител, меченых пероксидазой хрена(1 ч при 37 С). Повторяли процедуру отмывки и проявляли реакцию по расщеплению субстрата. Раствор субстрата готовили непосредственно перед использованием следующим образом 0,01 гр. 4 хлор-нафтола (, США), растворяли в 2 мл 3 23891 метанола, смешивали с 18 мл ФСБ (рН 7,2-7,4) и добавляли 0,01 мл 3 перекиси водорода. Для исследования использовали пробы сыворотки крови от собак зараженных описторхозом. В качестве отрицательного контроля использовали пробы сыворотки крови здоровых собак. Всего было исследовано 9 проб сывороток крови (таблица). Результаты тестирования сывороток крови Примечание- положительная реакция - - отрицательная реакция В результате проведенных исследований методом ИФА и иммуноблотинга были получены результаты,согласно которым полученный экскреторно-секреторный антиген вступает в реакцию со специфическими антителами сыворотки крови в титрах 1800-112800 (ИФА). В иммуноблотинге 5 проб сывороток крови связывались с антигенными детерминантами экскреторно-секреторного антигена с молекулярными массами 66 и 100 кД. Отрицательный результат с 4 пробами объясняется отсутствием живых гельминтов в организме собак и как следствием низким уровнем антител к метаболическому компоненту. Таким образом, тестирование экскреторносекреторного антигена описторхов показало его специфичность и сероактивность в иммуноферментном анализе и иммуноблотинге. Полученный антиген может найти применение как основной реагент тест-систем предназначенных для серологической диагностики описторхоза животных. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ приготовления экскреторносекреторного антигена для серологической диагностики описторхоза,включающий культивирование марит описторхов с последующей очисткой и концентрацией культуральной жидкости,отличающийся тем, что для культивирования используют неполную синтетическую среду Игла.