Способ приготовления антигенного эритоцитарного диагностикума для выявления больных бруцеллезом животных

(51) 61 10/00 (2010.01) 61 39/10 (2010.01) 12 1/20 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ выявления больных бруцеллезом животных,включающий выращивание штамма бруцелл, смыв выросшей культуры формализированным физиологическим раствором,инактивацию бактериальных клеток нагреванием и сенсибилизацию формалинизированных танинизированных эритроцитов барана специфическим фагом Тб, в качестве антигена используют 100 млрд., взвесь инактивированных микробных клеток штаммаВ-0100 с адсорбированными фагами Тб ив равных соотношениях, в количестве 10-100 частиц на 1 клетку, в течение 22-24 часов при температуре 24, которую смешивают в равных объемах с 5,0 взвесью формализированных танинизированных эритроцитов барана, выдерживают в водяной бане при температуре 50 в течение 120 мин,периодически, с интервалом 15 мин встряхивают,затем смесь антигена и эритроцитов дважды отмывают физиологическим раствором 7,2,путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 15 мин, ресуспендируют в этом же растворе до первоначального объема,затем вновь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин,надосадочную жидкость удаляют, супернатант сенсибилизированных эритроцитов консервируют 0,05 раствором азида натрия и получают целевой продукт.(72) Барамова Шолпан Аузаровна Султанов Ахметжан Акиевич Оспанов Ержан Калиолдинович Алпысбаева Сабира Егизбаевна Хизат Серк(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ АНТИГЕННОГО ЭРИТОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ БОЛЬНЫХ БРУЦЕЛЛЕЗОМ ЖИВОТНЫХ(57) Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности, к лабораторной диагностике бруцеллеза животных, а именно к способам разработки эффективных методов, предназначенных для ускоренной серологической диагностики бруцеллезной инфекции. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в повышении специфичности, чувствительности и стандартности приготавливаемого иммунологического реагента и ускоренном выявлении бруцеллеза сельскохозяйственных животных. Способ приготовления антигенного эритроцитарного бруцеллезного диагностикума для 25392 Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к лабораторной диагностике бруцеллеза животных, а именно к способам разработки эффективных методов, предназначенных для ускоренной серологической диагностики бруцеллезной инфекций. Известен способ приготовления антигенного эритроцитарного диагностикума для выявления больных бруцеллезом животных, включающий выращивание штамма бруцелл, смыв выросшей культуры формалинизированным физиологическим раствором, инактивацию бактериальных клеток нагреванием и сенсибилизацию формалинизированных танинизированных эритроцитов барана специфическим фагом Тб (Патент Республики Казахстан 162, кл. А 61 39/10, 01 33/531,1992). Однако известный способ не обеспечивает высокой чувствительности и специфичности препарата. Задачей изобретения является приготовление высокочувствительного,специфичного и стабильного антигенного эритроцитарного диагностикума, содержащего специфические фаги для выявления больных бруцеллезом животных в РГА, как в острой, так и в хронической форме. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в повышении специфичности, чувствительности и стандартности приготавливаемого иммунологического реагента и ускоренном выявлении бруцеллеза сельскохозяйственных животных. Способ приготовления антигенного эритроцитарного диагностикума для выявления больных бруцеллезом животных, включающий выращивание штамма бруцелл, смыв выросшей культуры формалинизированным физиологическим раствором,инактивацию бактериальных клеток нагреванием и сенсибилизацию формалинизированных танинизированных эритроцитов барана специфическим фагом Тб, в качестве антигена используют 100 млрд взвесь инактивированных микробных клеток штаммаВ-0100 56 с адсорбированными фагами Тб ив равных соотношениях, в количестве 10-100 частиц на 1 клетку, в течение 22-24 часов при температуре 24, которую смешивают в равных объемах с 5,0 взвесью формализированных танинизированных эритроцитов барана, выдерживают в водяной бане при температуре 50 в течение 120 мин,периодически, с интервалом 15 мин встряхивают,затем смесь антигена и эритроцитов дважды отмывают физиологическим раствором 7,2,путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 15 мин, ресуспендируют в этом же растворе до первоначального объема,затем вновь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин,надосадочную жидкость удаляют, супернатант сенсибилизированных эритроцитов консервируют 0,05 раствором азида натрия и получают целевой продукт. Для приготовления бруцеллезного антигена используют штаммВ-0100 56,2 который хранится в коллекции Лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов ТОО Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт (КазНИВИ). Штамм бактерийВ-0100 56. Штамм характеризуется следующими признаками. Происхождение штамма бактерий. Штамм бактерий выделен от больной бруцеллезом коровы из Алматинской области, способ выделения -МПБ,МПА, эритрит агар с добавками и отбора колоний в-форме по Уайт-Вильсону. Идентифицирован по определителю бактерий/, 2005,, . 370386. Сравнен с типовым штаммом коллекционный 19 (вакцинный)544(эталонный). Назначение штамма бактерий. Штамм типовой для приготовления диагностических и профилактических препаратов. Состав среды и условия культивирования. Панкреатический гидролизат кильки, натрия хлорид,тиамин-бромид,глюкоза,глицерин,эритрит, агар-агар, дрожжевой экстракт, -цистин,Т 37-38. Морфолого-культуральные свойства. Вегетативные клетки растут на эритрит-агаре с добавками, Т 37-38, в течение 48 часов в термостате. Грамотрицательные коккобациллы, длиной 0,42,5 мкм, шириной 0,4-0,6 мкм, неподвижны,очертания концов округлые, клеточные стенки содержат липополисахарид, консистенция -формы. Физиолого-биохимические свойства. Принадлежность к трофической группе хемоорганотроф. Типы катабализма аэроб. Симбиотрофные отношения внутриклеточный паразитизм. Источники углерода глюкоза,глицерин. Источники азота гидролизат животных белков. Источники серы цистин. Другие характерные физиологические особенности обмена дифференцирующие и диагностические ферменты оксидаза, каталаза,образует сероводород, не разжижает желатин, не лизирует эритроциты,не образует ацетилметилкарбинол. Маркерные признаки штамма. Растет на средах с пенициллином, обладает оксидазной, каталазной активностью. Способ, условия и состав сред для хранения. Основные биологические свойства штамма стабильно сохраняются при многократных пассажах. В нативном состоянии не снижает активности 6 месяцев на твердых средах (МПА, эритрит-агар) при температуре 4 С. В замораживающей среде с глицерином, хранится при температуре - 80 С. Способ, условия и состав сред для размножения штамма эритрит агар с добавками (дрожжевой экстракт, -цистин, 1 глюкоза, 2 глицерин). 25392 Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Пример 1. Приготовление бруцеллезного антигена, содержащего специфические фаги Тб идля адсорбции на эритроциты барана. Основой для приготовления антигена служат штамм В-0100 56 и специфические фаги Тб и . Бактериальную массу для получения антигена выращивают на эритрит-агаре. Репродукцию фага Тб иосуществляют в бактериальных клетках штаммаВ 0100 56 в обычной для бруцелл жидкой питательной среде. Бруцеллезные фаги Тб иадсорбируют на клетках бруцелл в равных соотношениях из расчета 100 фаговых корпускул на 1 микробную клетку в течение 22-24 час при температуре 2-4. Затем взвесь бактерий с адсорбированными фагами центрифигируют при 5000-6000 об/мин в течение 30 мин и сливают надосадочную жидкость. Из супернатанта готовят 100 млрд взвесь на 0,5 формализированном физиологическом растворе. Пример 2. Приготовление антигенного эритроцитарного бруцеллезного диагностикума,содержащего специфические фаги Тб и . Равные объемы 100 млрд взвеси бруцелл с адсорбированными фагами смешивают с 5,0 взвесью формализированных танинизированных эритроцитов барана, выдерживают в водяной бане при температуре 50 в течение 120 мин,периодически, с интервалом 15 мин, встряхивают,затем смесь антигена и эритроцитов дважды отмывают физиологическим раствором рН 7,2,путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 15 мин, ресуспендируют в этом же растворе до первоначального объема,затем вновь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин,надосадочную жидкость удаляют, супернатант сенсибилизированных эритроцитов консервируют 0,05 раствором азида натрия. Далее изготовленные диагностикумы используют в реакции непрямой гемагглютинации(РНГА) для исследования животных на бруцеллез. Пример 3. Определение чувствительности эритроцитарного бруцеллезного антигенного диагностикума, содержащего специфические фаги Тб и . Изучение чувствительности приготовленных по указанному способу, содержащих специфические фаги диагностикумов, проводят в реакции непрямой гемагглютинации путем исследования 10 серий заведомо известных бруцеллезных (биофабричных) сывороток, а также 40 проб сывороток крови,полученных от 20 экспериментально зараженных бруцеллезом морских свинок и 20 кроликов. Для сравнительного анализа полученных результатов эти же пробы опытных сывороток параллельно исследуют в РНГА с антигенными эритроцитарными бруцеллезными диагностикумами Одесской биофабрики, а также антигенами собственного изготовления, не содержащих фаги. Предварительно все пробы испытуемых сывороток исследуют общепринятыми методами в РА, РДСК, РБП, результаты которых были во всех случаях положительными и свидетельствуют о наличии высоких титров бруцеллезных антител. Результаты чувствительности антигенных эритроцитарных бруцеллезных диагностикумов представлены в таблице 1. Из таблицы 1 видно, что чувствительность предлагаемого диагностикума,содержащего специфические фаги достаточно высокая - титр обнаруживаемых им противобруцеллезных антител составляет 13200, а с помощью диагностикумов,изготовленных без дополнительной сенисибилизации специфическим фагом - 1400. Пример 4. Определение специфичности эритроцитарного бруцеллезного антигенного диагностикума, содержащего специфические фаги Тб и . Изучение специфичности приготовленных по указанному способу, содержащих специфические фаги диагностикумов, проводят в РНГА путем исследования 10 серий заведомо известных иммунных овисных (биофабричных) сывороток, 36 проб сывороток крови,полученных от экспериментально зараженных В.24 морских свинок и 12 кроликов, а также туляремийной,пастереллезной,йерсиниозной,вибриозной,сальмонеллезной иммунных сывороток и проб сывороток крови от интактных животных. Предварительно все пробы овисных иммунных сывороток исследуют в РДСК биофабричными овисным и бруцеллезными антигенами. Во всех случаях в РДСК с овисным антигеном получают положительные результаты, а с бруцеллезным антигеном показания были отрицательными. Проверенные таким образом овисные иммунные сыворотки используют в РНГА для изучения специфичности предлагаемого антигенного диагностикума. Результаты специфичности эритроцитарных бруцеллезных антигенных диагностикумов приведены в таблице 2. В таблице 2 показано, что предлагаемый диагностикум, содержащий фаги обладает высокой специфичностью, т.к. не вступает в реакцию с гетерологичными и негативной сыворотками. Так,при исследовании близкородственных иммунных сывороток (овисной, йерсиниозной, туляремийной,пастереллезной) показания РНГА были отрицательными, что доказывает наличие высокой специфичности разработанного эритроцитарных антигенного диагностикума,содержащего бруцеллезные фаги. При этом диагностикумы, не содержащие специфические фаги, вступают в перекрестные реакции в невысоких разведениях, с гетерологичными иммунными сыворотками - в первых двух лунках планшетки отмечают четырех и двукрестовые показания реакции с разведениями сывороток 125 и 150. Использование способа приготовления антигенного эритроцитарного диагностикума для выявления больных бруцеллезом животных 3 25392 позволит повысить специфичность,чувствительность и обнаружить инфицированный организм, как в острой, так и в хронической форме. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ приготовления антигенного эритроцитарного диагностикума для выявления больных бруцеллезом животных, включающий выращивание штамма бруцелл, смыв выросшей культуры формалинизированным физиологическим раствором, инактивацию бактериальных клеток нагреванием и сенсибилизацию формалинизированных танинизированных эритроцитов барана специфическим фагом ТБ, отличающийся тем, что в качестве антигена используют 100 млрд., взвесь инактивированных микробных клеток штаммаВ-0100 с адсорбированным фагами ТБ ив равных соотношениях, в количестве 10-100 частиц на 1 клетку, в течение 22-24 часов при температуре 2-4, которую смешивают в равных объемах с 5,0 взвесью формализированных танинизированных эритроцитов барана,выдерживают в водянной бане при температуре 50 в течении 120 мин, переодически, с интервалом 15 мин встряхивают, затем смесь антигена и эритроцитов дважды отмывают физиологическим раствором 7,2, путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 15 мин, ресуспендируют в этом же растворе до первоначального объема,затем вновь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин,надосадочную жидкость удаляют, супернатант сенсибилизированных эритроцитов консервируют 0,05 раствором азида натрия и получают целевой продукт.