Способ приготовления антигенного эритроцитарного диагностикума для выявления больных бруцеллезом животных

(51) 61 10/00 (2010.01) 61 39/10 (2010.01) 12 1/20 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ бруцеллеза животных и может быть использовано в микробиологии и иммунологии. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении эффективного антигенного эритроцитарного диагностикума для выявления больных бруцеллезом животных. Способ изготовления антигенного эритроцитарного диагностикума для выявления больных бруцеллезом животных путем сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана антигеном из штамма 19 разрушенных ультразвуком в присутствии конъюгирующего агента танина при температуре 65-70 С, экспозиции в течение 30 мин с последующим отмыванием эритроцитов, в качестве антигена используют штаммВ-0117 100.(72) Барамова Шолпан Аузаровна Султанов Ахметжан Акиевич Оспанов Ержан Калиолдинович Шманова Балымзия Тастановна(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт(56) Иванов Н.П. Бруцеллез животных методы и средства борьбы с ним. Алматы, 2002, с. 137-141(54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ АНТИГЕННОГО ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ БОЛЬНЫХ БРУЦЕЛЛЕЗОМ ЖИВОТНЫХ Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к лабораторной диагностике бруцеллеза животных и может быть использовано в микробиологии и иммунологии. Известен способ приготовления антигенного эритроцитарного диагностикума для выявления больных бруцеллезом животных путем сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана антигенами из штамма . 19 разрушенных ультразвуком в присутствии конъюгирующего агента танина при температуре 6570 С, экспозиции в течение 30 мин с последующим отмыванием эритроцитов. Иванов Н.П. Бруцеллез животных методы и средства борьбы с ним Алматы, 2002. -с.137-141. Недостатком известного способа является невысокая чувствительность и специфичность препарата. Задачей изобретения является получение высокочувствительного,специфичного и стабильного антигенного эритроцитарного диагностикума для выявления больных бруцеллезом животных. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в получении эффективного антигенного эритроцитарного диагностикума для выявления больных бруцеллезом животных. Способ приготовления антигенного эритроцитарного диагностикума для выявления больных бруцеллезом животных путем сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана антигеном из штамма 19 разрушенных ультразвуком в присутствии конъюгирующего агента танина при температуре 65-70 С, экспозиции в течение 30 мин с последующим отмыванием эритроцитов, в качестве антигена используют штаммВ-0117100. Для приготовления бруцеллезного антигена используют штаммВ-0117100,который хранится в коллекции лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов ТОО Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт (КазНИВИ). Штамм бактерийВ-0117100 Штамм характеризуется следующими признаками. Происхождение штамма бактерий. Штамм бактерий выделен от больной бруцеллезом коровы из Талдыкурганской области, способ выделения МПБ, МПА, гидролизная среда путем селекции и отбора колоний в-форме по Уайт-Вильсону. Идентифицирован по определителю бактерий/,2005,, . 370-386. Сравнен с типовым штаммом коллекционный 19 (вакцинный)544 Назначение штамма бактерий. Штамм типовой для приготовления диагностических и профилактических препаратов. Состав среды и условия культивирования. Панкреатический гидролизат кильки, натрия хлорид,тиамин-бромид,глюкоза,глицерин,эритрит, агар-агар, дрожжевой экстракт. Т 3738 С. Морфолого-культуральные свойства. Вегетативные клетки растут на эритрит-агаре с добавками, Т 37-38 С, в течение 48 часов в термостате. Грамотрицательные коккобациллы, длиной 0,4 2,5 мкм, шириной 0,4 - 0,6 мкм, неподвижны,очертания концов округлые, клеточные стенки содержат липополисахарид, консистенцияформы. Физиолого-биохимические свойства. Принадлежность к трофической группе хемоорганотроф. Типы катабализма аэроб. Симбиотрофные отношения внутриклеточный паразитизм. Источники углерода глюкоза, глицерин. Источники серы цистин. Другие характерные физиологические особенности обмена дифференцирующие и диагностические ферменты уреаза, оксидаза,каталаза, образует сероводород, не разжижает желатин, не лизирует эритроциты, не образует ацетилметилкарбинол. Маркерные признаки штамма. Растет на средах с пенициллином, обладает уреазной, оксидазной,каталазной активностью. Штамм отличается от эпизоотических культур бруцелл слабой вирулентностью. Способ, условия и состав сред для хранения. Основные биологические свойства штамма стабильно сохраняются при многократных пассажах. В нативном состоянии не снижает активности 6 месяцев на твердых средах (МПА, эритрит-агар) при температуре 4 С. Способ, условия и состав сред для размножения штамма эритрит агар с добавками (дрожжевой экстракт,-цистин, 1 глюкоза, 2 глицерин). Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Пример 1. Приготовление сенситина из бруцелл для адсорбции на эритроциты барана. Антиген для сенсибилизации эритроцитов готовят путем разрушения бруцелл ультразвуком(50 млрд. взвесь микробных клеток дезинтегрированных в течение 15-30 минут ультразвуком с частотой 22 кГц и мощностью 70 100 вт/см 2 ) и последующего центрифугирования при 6000 об/мин 30 минут. Надосадочную часть декантируют и используют в качестве сенситина. Пример 2. Приготовление антигенного эритроцитарного диагностикума. Формалинизированные эритроциты,обрабатывают танином, с этой целью берут равные объемы (11) раствора танина (120000) и 5 взвеси эритроцитов тщательно смешивают и выдерживают в водяной бане 15 минут при температуре 37-38 С. После этого обработанные танином эритроциты 3-4 кратно отмывают от танина физиологическим раствором (рН 7,2) с помощью центрифугирования при 1000 об/минуту в течение 10 минут. Отмытые эритроциты собирают с центрифужных пробирок и доводят их до первоначального объема(5 взвесь) с физиологическим раствором с рН 6,26,4. В качестве антигена используется ультразвуковой лизат бруцелл. С этой целью готовят последовательные разведения антигена на физиологическом растворе с рН 6,2-6,4 начиная с 15 и далее 110 120 1 40 180 до 11280. Сенсибилизация формалинизированных и танизированных эритроцитов барана антигеном в указанных разведениях проводится в серологических пробирках в течение 10-15 минут при температуре 65-70 С. Затем эритроциты отмывают физиологическим раствором от излишек антигена, ставят реакцию с заведомо известными позитивной и негативной сыворотками. Титром антигена считается предельное его разведение, которое обеспечивает агглютинацию эритроцитов положительной сывороткой в предельном ее разведении. Для сенсибилизации эритроцитов используют вытитрованный антиген из расчета 4 антигенных единицы на 1,0 см 3 5-ной взвеси эритроцитов. С этой целью берут антиген в двойном титре. Допустим, что при титрации получен титр антигена 1100, для сенсибилизации эритроцитов берут разведение антигена 150, то есть в два раза больше и смешивают с эритроцитарной взвесью в соотношении 21, то есть два объема антигена и один объем взвеси эритроцитов. В этом случае получают 4 антигенных единицы. Готовят рабочий раствор антигена, то есть растворяют в необходимом объеме физиологического раствора с рН 6,2-6,4 двойную дозу предельного титра ультразвукового лизата бруцелл. Затем готовят в половинном к антигену объеме 5-ную взвесь эритроцитов. Приготовленный антиген и эритроциты смешивают,тщательно встряхивают и помещают в водяную баню при температуре 70 С на 15-20 минут. К титру антигена 110, то есть к 1,0 см 3 антигена прибавляют 4,0 см 3 физиологического раствора (рН 6,4). Затем берут 40 см 3 5 -ной взвеси эритроцитов, обработанных танином, то из этого количества 10,0 см 3 эритроцитарной взвеси оставляют для контроля(то есть без сенсибилизации) и 30,0 см 3 - для сенсибилизации. На это количество эритроцитов требуется 60,0 см 3 раствора антигена, где будет содержаться 6,0 см 3 чистого антигена и 54,0 см 3 физраствора, то есть 110. Таким образом,при сенсибилизации эритроцитов смешивают 30,0 см 3 5-ной взвеси эритроцитов и 60,0 см 3 раствора антигена. По истечении времени сенсибилизации эритроциты трижды отмывают физиологическим раствором с добавлением к нему (до 1) нормальной лошадиной сыворотки. В случаях использования диагностикумов в течение 1-2 мес после приготовления для консервации применяют 0,1 раствор азида натрия. При длительном хранении диагностикумов, их консервацию проводят следующим образом первоначально отмывают 0,1 раствором азида натрия (5-10- кратным объемом) на центрифуге при 1500-2000 об/мин в течение 10 мин. Полученный осадок покрывают глицерином и хранят при 4 С. При последующем применении консервированных диагностикумов их отмывают от глицерина физиологическим раствором,ресуспензируют этим же раствором до изначальной концентрации. Пример 2. Диагностикум эритроцитарный бруцеллезный антигенный проверяют на внешний вид, растворимость, гомогенность, влажность,стерильность,концентрацию эритроцитов,активность, специфичность. Внешний вид определяют визуально,просматривая флаконы в проходящем свете. Флаконы должны быть целыми, без трещин и иметь одинаковый объем содержимого. Одновременно флаконы проверяют на плотность укупорки и правильность этикирования. Для определения растворимости во флакон с сухой аморфной массой добавляют 11 см 3 0,9 ного раствора натрия хлорида, при этом должна образоваться равномерная взвесь коричневого цвета, без видимых скоплений эритроцитов, в течение одной минуты. Для определения гомогенности 5 -ную взвесь диагностикума разводят в 10 раз 0,9 -ным раствором натрия хлорида до получения 0,5 -ной концентрации, затем каплю такой взвеси наносят на предметное стекло, покрывают стеклом и микроскопируют при малом увеличении микроскопа. Эритроциты должны располагаться изолированно, при этом могут встречаться и небольшие скопления, не более чем по 10 эритроцитов и не более 3 скоплений в 10 полях зрения. Влажность должна быть не выше 3 . Диагностикум на стерильность не проверяют. Консервант азид натрия в разведении 1500. Для определения концентрации эритроцитов диагностикум содержащий 5 -ную взвесь разводят и получают 2,5-ную взвесь которую далее разводят 0,9 -ным раствором натрия хлорида в 200 раз. Затем каплю взвеси помешают в камеру Горяева и подсчитывают с помощью микроскопа количество эритроцитов. Для получения удовлетворительного результата подсчитывают не менее 5 больших квадратов или 80 маленьких. Для каждой серии подсчет эритроцитов проводят 2 раза. Препарат отвечает требованиям, если он содержит в 1,0 см 32,5-ной взвеси не более 550 000 эритроцитов. Определение специфичности и активности. Эритроцитарный антигенный диагностикум проверяют на активность и специфичность с(сальмонеллезный,колибактериозный, пастериллезный, овисный),разводят их физиологическим раствором 15 и инактивируют при 56 С в течение 30 минут. Для постановки реакции готовят физиологический раствор с добавлением к нему инактивированной нормальной лошадиной сыворотки (НЛС), из расчета 1,0 см 3 сыворотки на 100,0 см 3 физиологического раствора, инактивируют НЛС путем прогревания ее в разведении 15 при 56 С в течение 30 минут. Реакцию ставят в лунках полистироловых пластин. С этой целью во все лунки наливают по 0,05 см 3 раствор НЛС и затем такой же объем инактивированной и разведенной 15 гетерологичные сыворотки. Таким образом, первое разведение равно 110 и далее путем последовательного разведения переливают из одной лунки в другую по 0,05 см 3 сыворотки. Из последней лунки 0,05 см 3 выливаем. Следовательно, во второй сыворотка будет разведена 120, в третьей - 140, в четвертой - 180 и т.д. Затем титрацию каждой сыворотки проводят индивидуально пипеткой и не допускают разбрызгивания жидкости при титрации сыворотки. После чего во все лунки вносят 0,025 см 3 эритроцитарного диагностикума в концентрации 0,5. Эритроциты добавляют так, чтобы капли не стекали по стенке, а падали непосредственно в жидкость. Содержимое луночек тщательно, но осторожно перемешивают встряхиванием пластины до получения гомогенной суспензии. Пластины оставляют при комнатной температуре. Реакция наступает через 2-3 часа. Учет реакции проводят через 3 часа. К реакции ставят следующие контроли-с заведомо известными отрицательной и положительной сыворотками (агглютинационный титр которой не ниже 11600)сенсибилизированные эритроциты танизированные,но несенсибилизированные эритроциты. При обнаружении в сыворотках гетерогемагглютининов их следует адсорбировать 50 взвесью формалинизированных эритроцитов. Для этого к 1,0 см 3 сыворотки добавляют 0,1 см 3 взвеси формалинизированных эритроцитов, смесь встряхивают и оставляют на 1 час при комнатной температуре. Затем сыворотку отстаивают и надосадочную жидкость отсасывают и получают целевой продукт. Учет реакции непрямой гемагглютинации проводят визуально в крестах по схеме-(4 креста) - 100 -ная агглютинация эритроцитов, гладкий налет по всему дну лунки,возможно сползание и заворачивание краев агглютината в виде зонтика- (3 креста) - 75-ная агглютинация в виде хорошо выраженного зонтика меньшего диаметра, чем при оценке реакции на 4 креста. В центре лунки возможно образование малозаметного кольца из осевших неагглютинированных эритроцитов- (два креста) - на дне лунки осевшие неагглютинированные эритроциты образуют ровное кольцо с зернистостью вокруг него (50 -ная агглютинация)- (1 крест) - эритроциты оседают в виде компактной пуговки или колечка. Специфичность разработанных диагностикумов исследуют на гетерологичных сыворотках(сальмонеллезный,колибактериозный,пастериллезный, овисный), а также сыворотках здоровых животных. При учете реакции результаты должны быть отрицательными. За титр антител принимают наибольшее разведение сыворотки, в котором произошла четкая агглютинация эритроцитов с оценкой 4 или 3 креста. Все сыворотки, давшие РНГА с оценкой в 2 или 1 крест, считают отрицательными. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ приготовления антигенного эритроцитарного диагностикума для выявления больных бруцеллезом животных путем сенсибилизации формализированных эритроцитов барана антигеном из штамма 19 разрушенных ультразвуком в присутствии конъюгирующего агента танина при температуре 65-70 С, экспозиции в течении 30 мин с последующим отмыванием эритроцитов,отличающийся тем, что в качестве антигена используют штаммВ-0117100.