Штамм бактерий Salmonella choleraesuis B-0087, используемый для приготовления инактивированной вакцины против сальмоноллеза свиней

(51) 12 1/20 (2011.01) 12 1/42 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ используемый для приготовления инактивированной вакцины против сальмонеллеза свиней. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в изыскании иммуногенного штамма бактерийВ-0087, который является возбудителем сальмонеллеза свиней, природного для получения высокоиммуногенной вакцины. Штамм бактерийВ-0087 П-23 использовали для приготовления инактивированной вакцины против сальмонеллеза свиней, депонирован в Лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов ТОО Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ-0087, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ САЛЬМОНОЛЛЕЗА СВИНЕЙ(57) Изобретение относится к области ветеринарии,в частности ветеринарной микробиологии и представляет собой штамм бактерий , 25305 Изобретение относится к области ветеринарии, в частности ветеринарной микробиологии и представляет собой аттенуированный штамм бактерий, используемый для приготовления инактивированной вакцины против сальмонеллеза свиней. Известен штамм бактерий-0005, (КазНИВИ), используемый для получения инактивированной вакцины против сальмонеллеза поросят (Каталог культур микроорганизмов.Алматы, 2005-с. 176). Известный штамм бактерий, не обладает высокой иммуногенной активностью. Задачей данного изобретения является получение аттенуированного штамма бактерийсо слабой остаточной вирулентностью и высокой иммуногенной активностью. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в получении безвредного и иммуногенного аттенуированного штамма бактерий. Штамм бактерий-0087 депонирован в Лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов ТОО Казахский научно исследовательский ветеринарный институт(КазНИВИ), используемый для приготовления инактивированной вакцины против сальманеллеза свиней. Идентификацию штамма бактерийпроводят по основным культурально морфологическим, биохимическим и антигенным свойствам, согласно определителю, 2005,2,, . 764 - 799. Селекция штамма. Штамм бактерий-0087, выделен из трубчатой кости 45 дневного поросенка. Костный мозг из бедренной кости засевают пастеровской пипеткой в мясопептонный бульон(МПБ). Посевы культивируют в термостате при 37 С 18 - 24 часов,отмечается равномерное помутнение МПБ. Затем с МПБ проводят посевы на висмут - сульфитный агар,среду Эндо и на (мясопептонный агар) МПА. При посеве отдельных колоний сальмонелл, выделенных с МПА на чашках Петри, отмечалось, что при пересеве их в МПБ при 20 часах инкубации и дальнейшем пересеве в одинаковой дозировке 1,0 см 3 на 10,0 см 3 МПБ отмечалось неодинаковое накопление бакмассы. Значительная временная разница в интенсивности роста культур указывает на то, неоднородность популяции-0087, по своей репродуктивной активности. Для получения однородного популяционного свойства бактерий, обладающих сравнительно короткой лагфазой,сопровождающейся накоплением более высокой бактериальной массой,были проведены исследования по селекции отдельных колоний сальмонелл с активными ростовыми свойствами. 2 Клоны сальмонелл, выросших на чашках Петри с МПА, дают наиболее обильный рост. Накопление бактериальной массы определяют по сальмонеллезному бактериальному стандарту мутности ГИСК им.Тарасевича. Селекционное выделение клонов, отличающихся по скорости репродукции, проводят последовательно двукратно,затем клоны размножают и после этого изучают их активность по наибольшему накоплению бактериальной массы. В результате проведенных исследований был выделен изолят 23 из популяции штамма, который и выбран для дальнейшей работы, так как за 20 часов культивирования в термостате на МПБ накопление бактериальной массы составляло более 3 миллиардов микробных клеток в 1 мл МПБ. При повторной проверке выбранного штамма(изолят 23) через 3 месяца после хранения на полужидком агаре под вазелиновым маслом под резиновыми парафинированными пробками устанавливают стабильность клона в быстроте роста, что указывает на целесообразность его использования при проведении дальнейших исследований по отбору штамма для изготовления вакцинного препарата. Штамм бактерийВ-0087 П-23 депонирован в коллекции микроорганизмов ТОО Казахский научно-исследовательский институт. Морфологические признаки. Штамм бактерийВ-0087- палочки с закругленными краями, реже овоидной формы, 2-4 мкм в длину и 0,2-0,6 мкм в ширину. Сальмонеллы подвижны, с перитрихиально расположенными жгутиками, легко окрашиваются анилиновыми красками, грамотрицательные. Спор и капсул не образуют. Культуральные свойства. Сальмонеллы - аэробы или факультативные аэробы. Хорошо развиваются на обычных питательных средах, оптимальная температура роста 37 С, при рН среды 7,2 - 7,6. На МПБ штамм бактерийобразует равномерное помутнение со слизистым осадком, на МПА - серовато - голубоватые опалесцирующие колонии, вокруг которых иногда образуются периферические валики. При хранении культуры довольно быстро диссоциируют вформы. На среде Эндо сальмонеллы образуют слегка розоватые прозрачные колонии на висмут сульфитном агаре мелкие черные колонии с металлическим блеском, участки среды под колонией также окрашиваются в черный цвет на среде Плоскирева - бесцветные колонии. Для культивирования сальмонелл используют также среды накопления - селинитовую, Мюллера,Кауфмана, Киллиана. На среде Эндо колонии белого цвета. Слегка розоватые, прозрачные, блестящие с ровными краями. Учет характера роста необходимо проводить через 24-48 часов. В мясопептонном бульоне образуют равномерное помутнение среды. Биохимические свойства. Штамм бактерий-0087 не изменяет инозит,глицерино-фуксиновый бульон,раффинозу, 25305 салицин не образует сероводорода. Не ферментирует мочевину, лактозу, сахарозу, не разлагает желатин,не образует индола. Ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, галактозу, маннозу, арабинозу, рамнозу,маннит, мальтозу, дульцит, сорбит. Антигенная структура. У штамма бактерийВ-0087 два основных антигенных комплекса О - антигена (соматический) термостабильный 4,12 Н-антиген(термолабильный), белковой природы 2 -я фаза е, ,х. 1-я фаза Н - антигена отсутствует. О- и Нантигены вызывают образование различных антител, отличающихся по характеру агглютината. О агглютинация мелкозернистая,клетки соединяются полярными поверхностями, образуя мелкие агрегаты. Н - агглютинация характеризуется образованием хлопьевидного рыхлого агглютината,клетки соединяются своими жгутиками, происходит их полное обездвиживание. На основании общности соматических антигенов сальмонеллы объединены в серологические группы,которые обозначены прописными буквами латинского алфавита А. В, С, Д, и др.относится к серологической группе С. Внутри группы сальмонеллы дифференцируются на основании особенностей Н - антигенов, при этом 1-я фаза обозначается строчными буквами латинского алфавита, у-0087 1-я фаза отсутствует. 2-я фаза обозначается арабскими цифрами или латинскими буквами е, , х. Для идентификации сальмонелл путем иммунизации кроликов готовят монорецепторные сыворотки к каждому антигену (например, к О-антигенам 4, 5, 7, 9 и т. д. и Н - антигенам , 1, 2, с и др). Сначала определяют по О-антигену групповую принадлежность сальмонелл (реакция агглютинации на стекле), затем при помощи Н монорецепторных сывороток устанавливают типовую принадлежностью. Знание антигенной структуры сальмонелл необходимо при отборе штаммов в процессе изготовления вакцин и конструирования вакцинных препаратов. Штамм бактерий-0087 является эпизоотическим, обладает патогенными свойствами для свиней. За время хранения в лабораторных условиях штамм не изменил культурально-морфологические,биохимические свойства, также патогенность и антигенную структуру. Маркерные признаки штамма бактерий- 0087, полученный из вирулентной культуры под влиянием химического мутагена - нитрофурана с последующей селекцией мутантов, отличается слабой вирулентностью,выраженными иммуногенными свойствами,отсутствием абортогенных свойств. Не образовывает сероводород и индол,не ферментирует лактозу и сахарозу. Маркерным признаком является отсутствие продукции сероводорода. Существенным отличием от штамма-0087, от вирулентного прототипа является ауксотрофность в отношении тиамина и никотиновой кислоты штамм образует аргинин декарбоксилазу и слабо-лизиндекарбоксилазу. Вакцинный штамм не реверсирует при пассировании на восприимчивых животных(белые мыши, куриные эмбрионы). Титр сыворотки в РА 1800 -1 1600. Физиологические - прототроф, хемоорганотроф,обладает дыхательным и бродильным типом метаболизма. Аэроб. Серологические при типизации с диагностическими сальмонелезными сыворотками имеет постоянную реакцию с О-сывороткой 4, 12 и Н сывороткой 2 -я фаза е, , х. Патогенные свойства. Штамм бактерий-0087 обладает патогенными свойствами для белых мышей массой 16-18 граммов, вызывая гибель 9 из 10 мышей при подкожном введении 25 млн микробных клеток (0,2 мл 125 миллионной взвеси суточной культуры сальмонелл). Иммуногенность для белых мышей. Штамм бактерий-0087 обладает выраженной иммуногенностью для белых мышей массой 16,0 - 18,0 граммов, защищая 100 животных при двукратной подкожной иммунизации их инактивированной вакциной (2 млрд. микробных клеток в 1,0 мл) в дозе 0,5 мл с интервалом 7 дней и последующим заражением вирулентным штаммом на 10 сутки в дозе 50 млн. м. к. выживаемость опытных животных составила 100 (10) голов. Пример. Питательной средой для изготовления инактивированной вакцины против сальмонеллеза свиней служит бульон Хоттингера (200 -250 мг аминного азота), содержащий 10 , печеночного экстракта, 0,4 пептона. Для приготовления питательной среды используют основной перевар Хоттингера. На 1,0 кг мясного фарша добавляют 1,5 мл дистиллированной воды, подогретой до 40 С, и подщелачивают 20 раствором едкого натра, так чтобы концентрация водородных ионов была 7,8 8,0. Затем на каждый килограмм фарша добавляют 150 -170 г измельченной поджелудочной железы или 18,0 -20,0 г панкреатина и на каждый мл смеси -10,0 мл хлороформа. Ферментативное расщепление должно продолжаться 5-6 сут при 40 -45 С. Химические показатели качественного перевара общий азот -800-1200 мг аминный азот -500 -750 мг триптофан- 100 150 мг. Содержание (мг)общего азота определяют методом перегонки Къельдаля аминного азота (мг) - формольным титрованием триптофана (мг) - методом Пешкова. Приготовление печеночного экстракта. На 400 г свежей или свежезамороженной печени крупного рогатого скота или свиней, освобожденной от жира и пленок, измельченной на кусочки по 30,0-50,0 г добавляют 0,5 мл дистиллированной воды и кипятят в течение часа, после чего фильтруют через ватномарлевый фильтр. Приготовление питательной среды. Для приготовления питательной среды к над осадочной жидкости основного перевара Хоттингера добавляют дистиллированную воду с таким 3 расчетом, чтобы содержание аминного азота было не менее 200-250 мг. Затем добавляют 10 печеночного экстракта. 0,4 пептона 3-4 агара. Смесь кипятят в течение 30 минут, затем устанавливают рН среды до 7,7-7,8 путем добавления 20 едкого натра, добавляют 15 дистиллированной воды на выкипание, после чего добавляют 0,3 химически чистого хлорида натрия. После растворения указанных ингредиентов добавлением 20 едкого натра устанавливают рН 7,8 -9,0. Среду кипятят 30 минут, отстаивают 1 -1,5 часа, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Для контроля стерильности приготовленную питательную среду засевают на питательные среды мясопептонный агар (МПА), мясопептонный бульон(МПБ), мясопептонно - печеночный бульон под вазелиновым маслом (среда Китт - Тароцци). Готовая питательная среда должна быть стерильной,прозрачной или слегка опалесцирующей, рН 7,4-7,6 и содержать аминный азот 200 -250 мг. Приготовление посевного материала. Для изготовления вакцины каждый раз используют отдельную ампулу с лиофилизированной культурой. Каждый раз проверяют морфологические,культуральные и биохимические свойства и агглютинабельность штамма бактерий-0087 с монорецепторными сыворотками О-,и Н - ех. Бактерии штамма-0087 агглютинируются сыворотками О-//, //, Н - ех//. Ампулу с сухим штаммом вскрывают и добавляют в нее 2,0 мл стерильного физиологического раствора Полученную взвесь заливают по 1,0 мл в два флакона с бульоном Хоттингера (вместимость флакона 100,0 мл, объем среды - 1/3 флакона). Выращивают в термостате 14-15 часов при температуре(культура первой генерации). Культуру первой генерации проверяют на чистоту микроскопией мазков, окрашенных по Граму, типичность роста, стерильность и засевают 50 см 3 в бутыль, содержащую 10,0 мл бульона Хоттингера(культура второй генерации). Культивирование проводят при (371,0)С 18-20 часов. Культура второй генерации служит посевным материалом для получения в последующем биомассы. Выращенную и проверенную на чистоту суточную матриксную культуру второй генерации с соблюдением условий стерильности засевают в бутыли со стерильной питательной средой,охлажденной до 37-30 С из расчета 5-10 матриксной расплодки к общему объему(в перерасчете на сухое вещество) стерильного 40 раствора глюкозы 5 -10. Культуру, засеянную в бутыли, выращивают 1820 часов при (371,0)С с постоянным перемешиванием и непрерывной аэрации при(371,0)С. В процессе выращивания культуры через 5-6 часов после засева берут пробу для определения рН, чистоты роста и концентрации микробных тел. Добавляют 40 раствор глюкозы и продолжают выращивать еще в течение 4 -6 часов. Выращенную культуру проверяют на чистоту популяции путем микроскопии и высева в пробирки с МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом, агар Сабуро, на чашки Петри с МПА. Культура должна агглютинироваться монорецепторными сыворотками О - ,и Н - ех. После получения результатов,подтверждающих отсутствие загрязненияпосторонней микрофлорой выращенной культуры(просмотр посевов,микроскопия),производят определение концентрации микробных тел по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича. Микробную массу хранят при температуре от 2 до 4 С 1-1,5 суток. Культура сальмонелл должна иметь концентрацию 8-10 млрд. микробных клеток в 1 см 3 и рН 7,6 -7,8. Разведенную до 4 млрд. микробных клеток в 1 мл культуру переливают в 20 литровую бутыль и добавляют формалин, разведенный физиологическим раствором в соотношении 11, с расчетом конечной концентрации формалина 0,4. Инактивацию культуры формалином проводят в течение 5-6 суток при 37-38 С. После установления стерильности вакцину расфасовывают по 20, 50, 100,0 мл в стерильные флаконы, которые закрывают резиновыми пробками и обкатывают металлическими колпачками. Предложенный штамм бактерий-0087 эпизоотически актуален для свиноводческих хозяйств Республики Казахстан,изготовленная инактивированная вакцина из штамма-0087 является эффективной в профилактике сальмонеллеза свиней. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм бактерий-0087 П-23, депонирован в Лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов ТОО Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт,используемый для приготовления инактивированной вакцины против сальмонеллеза свиней