Штамм бактерий salmonella choleraesuis казниви в-0327, используемый для приготовления инактивированной вакцины против сальмонеллеза поросят

(51) 12 1/20 (2006.01) 12 1/42 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к области ветеринарии,в частности к ветеринарной микробиологии и представляет собой штамм,используемый для изготовления вакцины против сальмонеллза поросят. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в изыскании иммуногенного штамма,наиболее часто встречаемого при сальмонеллзе поросят, пригодного для получения высокоактивной вакцины. Штамм бактерийВ-0327(КазНИВИ-16), используемый для получения инактивированной вакцины против сальмонеллза поросят. Указанный штамм бактерий депонирован в лаборатории Музей культур микроорганизмов ДГП Научно-исследовательский ветеринарный институт (КазНИВИ).(72) Мырзахметова Балжан Шайзадаевна Титова Тамара Александровна(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский ветеринарный институт Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Научнопроизводственный центр животноводства и ветеринарии Министерства сельского хозяйства Республики Казахстан КАЗНИВИ В-0327,ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА ПОРОСЯТ 20803 Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к ветеринарной микробиологии и представляет собой штамм,используемый для изготовления вакцины против сальмонеллза поросят. Известен штамм бактерий родас-10, используемый для приготовления вакцины против сальмонеллза свиней Предварительный патент Республики Казахстан 5888, кл. А 61 К 39/112, 1998. Недостатком известного штамма является возможность реверсии клеток аттенуированного штамма по вирулентности,повышенная реактогенность и обострение течения эпизоотического процесса. Задачей изобретения является получение иммуногенного штамма,применение которого обеспечивает высокую иммуногенную активность при изготовлении инактивированной вакцины против сальмонеллза поросят. Технический результат,обеспечиваемый изобретением,выражается в изыскании иммуногенного штамманаиболее часто встречаемого при сальмонеллзе поросят пригодного для получения высокоактивной вакцины. Штамм бактерий-0327(КазНИВИ-16), используемый для получения инактивированной вакцины против сальмонеллза поросят. Указанный штамм бактерий депонирован в лаборатории Музей культур микроорганизмов ДГП Научно-исследовательский ветеринарный институт (КазНИВИ). Идентификацию штамма микроорганизмов проводят по основным морфологическим,культуральным и биохимическим свойствам,согласно определителю(1997 Справочное издание). Селекция штамма. Штамм-0327 (КазНИВИ-16), выделен из почки павшего поросенка принадлежащего животноводческому комплексу ТОО Караой Алматинской области. Из пораженных участков почки брали пробы пастеровской пипеткой и засевали в мясо-пептонный бульон (МПБ) и ставили в термостат на 18-24 ч. Затем с МПБ провели посев на среду Эндо, на Висмут-сульфит агар и МПА. При посеве отдельных колоний сальмонелл, выделенных с МПА на чашках Петри было замечено, что при посеве их в МПБ при 12 ч. инкубации и дальнейшем пересеве в одинаковой дозировке - 1 мл на 10 мл МПБ, накопление биомассы было неодинаковое. Такая временная разница в интенсивности роста культур указывала на то, что популяциянеоднородна по своей репродуктивной активности. Исходя из этого, в целях получения однородного популяционного свойства бактерий,обладающих сравнительно короткой лагфазой,сопровождающейся накоплением более высокой бактериальной массой была проведена работа по 2 селекции отдельных колоний сальмонелл с указанными свойствами. Для этого методом разведения выделяли клоны сальмонеллзной палочки, выросших в чашках Петри на МПА, которые при дальнейшем посеве в пробирки с МПБ давали наибольший рост. Накопление биомассы определяли по бактериальному стандарту мутности ГНКИ. Селекционное выделение клонов, отличающихся по скорости репродукции, проводили последовательно двукратно, затем их размножали и после этого изучали их активность по наибольшему накоплению бактериальной массы. Таким образом, в результате проведенных исследований был выделен изолят 16 из популяции штаммаВ-0327,который был более предпочтителен для дальнейшей работы, так как за 12 часов инкубирования в термостате на МПБ, накопление бакмассы составляло более 2,0 млрд/мл микробных клеток, у остальных изолятов этот показатель был ниже. При повторной проверке этого штамма через 3 месяца хранения на полужидком агаре под вазелиновым маслом была установлена его стабильность в быстроте роста, что указывает на целесообразность использования его в дальнейших исследованиях по изготовлению вакцинного препарата. Изолят 16 был условно обозначен штаммом-0327 (КазНИВИ-16), который депонирован в коллекции микроорганизмов ДТП НИВИ. Морфологические признаки. Бактерии штаммаграмотрицательные округлые палочки от 1-3 х 0,50,8 мкм, обладают полиморфизмом, подвижные за счет перитрихиальных жгутиков, спор и капсул не образуют. Культуральные свойства. На питательном агаре колонии гладкие с ровными краями, прозрачные,нежные, голубоватые. На среде Эндо колонии белого цвета слегка розоватые, прозрачные,блестящие с ровными краями. На Висмут-сульфит агаре колонии черные с металлическим блеском,прокрашивание среды под колонией в черный цвет. Учет характера роста необходимо просматривать через 24-48 ч. В мясопептонном бульоне образует равномерное помутнение среды. Факультативный анаэроб. Оптимальная скорость роста при температуре 37 С и рН 7,0-7,4. Биохимические свойства. Штамм бактерий-0327 (КазНИВИ-16) ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, галактозу, мальтозу, лактозу, арабинозу,маннит и с образованием кислоты рамнозу. Не ферментирует инозит, сахарозу, рафинозу, дульцит,не разжижает желатин. Не образует сероводород и индол. Антигенная структура. Штамм-0327 при серологической типизации с диагностическими сальмонеллзными сыворотками имел положительную реакцию с О сывороткой - 7 и Н сывороткой - с. Штамм(КазНИВИ-16) является эпизоотическим, 20803 обладает высокой вирулентностью для поросят. Во время вспышек болезни в животноводческом комплексе ТОО Караой Алматинской области,поражалось до 30 поросят в возрасте 25-50 дней. За время хранения штамма в лабораторных условиях он не потерял свои культуральноморфологические и патогенные свойства. Маркерные признаки штамма. Физиологические - прототроф. Биохимические - из углеводов постоянно не усваивает дульцит,усвоение рамнозы с образованием кислоты наблюдалось на 3 сутки. Серологические при типизации с диагностическими сальмонеллзными сыворотками имел положительную реакцию с О сывороткой - 7 и Н сывороткой - с. Патогенные свойства. Штамм-0327 (КазНИВИ-16), обладает вирулентностью вызывая гибель белых мышей(пять) массой 14-16 г при внутрибрюшинном введении 18-24 ч. культуры в дозе 100 млн микробных тел. Иммуногенность для белых мышей. Штамм обладает выраженной иммуногенностью для белых мышей. При двукратной подкожной иммунизации их инактивированной вакциной (4 млрд микробных тел в 1 мл) в дозе 0,5 мл, с интервалом 7 дней и заражением патогенным штаммомна 10 сутки в дозе 2 ДМ выживаемость мышей составила 100. Пример. Питательной средой для изготовления инактивированной вакцины служит перевар Хоттингера, в который добавляют печеночный экстракт-10,пептон-0,4,двузамещенный фосфорнокислый натрий -0,3 химически чистого хлорида натрия-0,3, рН среды -7,6-7,8. Среду кипятят, фильтруют через ватно-марлевый фильтр и переливают в стерильные бутыли. Для контроля стерильности приготовленную среду засевают на питательные среды мясопептонный агар (МПА), мясопептонный бульон Готовая питательная среда должна быть стерильной,прозрачной или слегка опалесцирующей, рН 7,4-7,6 и содержать аминного азота 200-250 мг. Выращенную и проверенную на чистоту матриксную культуру второй генерации с соблюдением условий стерильности, засевают в бутыли со стерильной питательной средой,охлажденной до 38 С из расчета 5-10 матриксной расплодки, к общему объему питательной среды,одновременно добавляют 0,1 стерильного 40 раствора глюкозы. Культуру, засеянную в бутыли, выращивают 2436 ч. при 37-38 С с постоянным перемешиванием и непрерывной аэрации при 37-38 С. В процессе выращивания культуры через 5-6 ч. после засева берут пробу для определения рН,частоты роста и концентрации микробных тел. Культура должна иметь 8-10 млрд. микробных тел в 1 мл и рН 7,6-7,8. Разведенную до 4 млрд. микробных клеток в 1 мл культуру переливают в 20 л бутыль и добавляют формалин разведенный физиологическим раствором в соотношении 11, с расчетом конечной концентрации формалина 0,4. Инактивацию культуры формалином проводят в течение 5-6 сут. при 37-38 С. После установления стерильности вакцину расфасовывают по 20, 50, 100 мл в стерильные флаконы, которые закрывают резиновыми пробками и обкатывают металлическими колпачками. Предложенный штамм эпизоотически актуален для свиноводческих хозяйств Казахстана, а изготовленная инактивированная вакцина включающая штаммВ-0327(КазНИВИ-16), является эффективной в профилактике сальмонеллза поросят. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм бактерий-0327-16),используемый для приготовления инактивированной вакцины против сальмонеллеза поросят.