Способ определения риска возникновения артериальной гипертонии у мужчин казахской национальности

(51) 01 33/50 (2006.01) 12 1/68 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ гипертонии у мужчин казахской национальности,позволяющего на доклиническом этапе развития заболевания выявлять гомозигот - носителей неблагоприятного сочетания генов,повышающего точность определения и дающего возможность для развития новых стратегий борьбы против сердечно - сосудистых заболеваний как осложнений АГ. Это достигается тем, что в способе определения риска возникновения артериальной гипертонии путем проведения молекулярно - генетических исследований и определения полиморфизма генов,как генетического маркера заболевания, согласно изобретению, используют кровь мужчин казахской национальности, из которой выделяют ДНК,проводят ее молекулярно - генетический анализ методом полимеразной цепной реакции, определяют полиморфизм генови ИАПГ-1, и при наличии аллеля Т генаи аллеля 5 гена ИАПГ-1 диагностируют предрасположенность к заболеванию артериальной гипертонии.(72) Джусипов Алихан Казахпаевич Байтасова Назия Багадурбековна Джолдасбекова Алия Утепбаевна(56) Баирова Т.А., Долгих В.В., Бимбаев А.Б. Молекулярно-генетические маркеры эссенциальной артериальной гипертензии Докл. (2 Всероссийская конференция Здоровый ребенок, Чита, 28-29 сентября 2004) // Бюллетень Вост.-Сиб. научного центра СО РАМН, 2004,3, с.100-106(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РИСКА ВОЗНИКНОВЕНИЯ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТОНИИ У МУЖЧИН КАЗАХСКОЙ НАЦИОНАЛЬНОСТИ(57) Изобретение относится к области медицины, а именно к кардиологии, и предназначено для раннего выявления артериальной гипертонии (АГ) у мужчин казахской национальности. Задачей изобретения является создание способа определения риска возникновения артериальной 21812 Изобретение относится к области медицины, а именно к кардиологии, и предназначено для раннего выявления артериальной гипертонии (АГ) у мужчин казахской национальности. Выполненные за последние годы фундаментальные исследования, посвященные изучению этиологии,патогенеза АГ и факторов предрасположенности к ней, позволяют заключить,что гипертония является заболеванием, имеющим генетически выраженный(наследственный) характер, на формирование которого оказывает влияние генетический фон популяции. Для наследования АГ характерен ряд особенностей, подтверждающих его полигенный характер. В этом случае используется подход с выделением генов-кандидатов, к которым относятся гены(метилентетрагидрофолатредуктаза) и ИАПГ-1 (ингибитор активатора плазминогена). Известен способ определения риска возникновения артериальной гипертонии путем определения полиморфных вариантов генов параоксоназы или альдостеронсинтазы, влияющих на развитие данной патологии.(Асадуллина Г.В. Липидный спектр мембран эритроцитов и полиморфные ДНК - локусы у больных эссенциальной гипертензией // М.,Медицина, с. 12-15). Недостатком данного способа является низкая эффективность, т.к. выявлена ассоциация генов липидного метаболизма в возникновении АГ,которая не может быть прогностическим критерием по данному заболеванию, как например система гемостаза и эндотелия, играющая ведущую роль в патогенезе АГ. Известен также способ определения риска возникновения артериальной гипертонии путем проведения молекулярно генетических исследований и определения полиморфизма Т 174 М гена ангиотензина, как возможного генетического маркера гипертонии.(Баирова Т.А., Долгих В.В., Бимбаев А.Б. Молекулярно - генетические маркеры эссенциальной артериальной гипертензии Докл.(2 Всероссийская конференция Здоровый ребенок,Чита, 28-29 сентября 2004) // Бюллетень Вост. - Сиб. научного центра СО РАМН. - 2004,3. - с. 100106). Недостатком данного способа также является то,что данный ген не является ведущим в развитии артериальной гипертонии в данной этнической группе, при этом важно учитывать в патогенезе развития артериальной гипертонии взаимодействие нескольких генов. Задачей изобретения является создание способа определения риска возникновения артериальной гипертонии у мужчин казахской национальности,позволяющего на доклиническом этапе развития заболевания выявлять гомозигот - носителей неблагоприятного сочетания генов, повышающего точность определения и дающего возможность для развития новых стратегий борьбы против сердечно сосудистых заболеваний как осложнений АГ. 2 Техническим результатом является повышение точности и эффективности способа. Это достигается тем, что в способе определения риска возникновения артериальной гипертонии путем проведения молекулярно - генетических исследований и определения полиморфизма генов, как генетического маркера заболевания, согласно изобретению, используют кровь мужчин казахской национальности, из которой выделяют ДНК,проводят ее молекулярно - генетический анализ методом полимеразной цепной реакции, определяют полиморфизм генови ИАПГ-1, и при наличии аллеля Т генаи аллеля 5 гена ИАПГ-1 диагностируют предрасположенность к заболеванию артериальной гипертонии. Способ осуществляется следующим образом. У пациента осуществляют забор крови из локтевой вены в объеме 5-10 мл в стерильные пластиковые пробирки, содержащие 100 мкл 0.5 М ЭДТА рН 8.0 в качестве антикоагулянта. Собранную таким образом кровь замораживают и хранят при 20 С. ДНК выделяют из лейкоцитов крови стандартным фенол-хлороформным методом(Маниатис Т. и др. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование Пер. с англ. Маниатис Т., Фрич Э., Сэм-брук Дж.-М. Мир,с.1084.-480, ил.). Лизис клеток проводят по методу Кан-келя ( ,.,, ,.--.. . 1992 25 193-205). К 500 мкл крови добавляют 500 мкл раствора для лизиса эритроцитов (29 мМ - 7.4, 10 мМ, 3 мМ 2, 5 сахароза, 1 тритон 00),инкубирют в течение 5 мин., осторожно перемешивая, и центрифугируют 10 мин. при 9 С,4000 об./мин. Супернатант сливают и осадок лейкоцитов ресуспендируют в растворе для лизиса мембран (29 мМ - 7.4, 10 мМ , 1 мМ 2, 0.25 сахароза). Смесь центрифугируют при тех же условиях, супернатант сливают. К осадку добавляют 300 мкл раствора для протеиназы К(0.01 М -, 0.01 , 0.01 ЭДТА рН 8.0),30 мкл 30 и протеиназу К до конечной концентрации 100 мкг/мл. Смесь инкубируют в течение 2-3 часов при 50 С для протеолиза. Получившийся в результате протеолиза гомогенный раствор последовательно обрабатывают 300 мкл фенола, 300 мкл смеси фенол-хлороформ в соотношении 1/1, 300 мкл хлороформа. После каждой экстракции в течение 10 мин. при аккуратном перемешивании смесь центрифугируют 10 мин. при 20 С, 4000 об./мин. и отбирают водную фазу. По окончании экстракции к водной фазе добавляют 1/10 объема 3 М ацетата натрия и 2 объема 96 этанола. Осадок ДНК центрифугируют при 9 С, 10000 об./мин. в течение 10 мин. Затем осадок дважды промывают 70 этанолом при тех же условиях центрифугирования, высушивают на 21812 воздухе и растворяют в 100 мкл стерильной воды. Выход ДНК составляет 40-50 мкг ДНК из 500 мкл цельной крови. В процессе выделения ДНК используют реактивы фирмы Вектон, Санкт-Петербург, Россия и , Германия. Для идентификации полиморфных аллелей в генах-фибриногена,и метилентетрагидрофолатредуктазы (/ -455, С 677 Т ) используют амплификацию соответствующих участков генов методом ПЦР с последующим рестрикционным анализом, в генах эндотелиальной-синтазы и ингибитора активатора плазминогена типа 1 (-, 4/5 -1) - методом ПЦР. Продукты ПЦР и рестрикционного анализа подвергают электрофо-ретическому разделению при 30 мА (150 В) в полиакриламидном геле (ПААГ) соответствующей концентрации в трис-боратном буфере (0.9 М -, 0.9 М борная кислота, 20 мМ ЭДТА), продолжительность электрофореза определяют по движению в ПААГ красителей ксиленцианола и бромфенолового синего, входящих в состав буфера для нанесения проб (водный раствор 0.25 ксилен-цианола, 0.25 бромфенолового синего, 30 глицерина), результаты визуализируют в УФ-свете после окрашивания бромистым этидием(Маниатис Т. и др. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование Пер. с англ. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж.-М. Мир,1084.-480 с. ил.). Амплификацию проводят на амплификаторе Терцик(термостат программируемый четырехканальный для проведения ПЦР анализа ТП 4-ПЦР-01 - Терцик ТУ 9452-001-46482062-98) в микроцентрифужных полипропиленовых пробирках с крышкой объемом 500 мкл (ФинБио) при помощи термостабильной высокопроцессивной рекомбинантнойДНК полимеразы фирмы(Литва). В исследовании используют реактивы следующих фирм - ,США(борная кислота), , Литва (смесь трифосфатов , бычий сывороточный альбумин , рестрикционные ферменты и буферы для них), , США (буфер для ПЦР, 2 для ПЦР). Для амплификации необходимого фрагмента генаиспользуют два праймера ( 9.0 при 25 С, 0.1 тритон Х-100, 1.5 мМ 2,0.25 мкМ каждого праймера, 200 мкМ , 1 единицу активности (1 ед.)ДНК полимеразы и 0.5-1 мкг геномной ДНК. Чтобы предотвратить испарение реакционной смеси в ходе ПЦР,наслаивают 25 мкл вазелинового масла. После первоначальной денатурации при 93 С в течение 3 мин. 35 циклов амплификации ведут в следующем температурно-временном режиме плавление 93 С- 50 сек., отжиг 55 С - 50 сек., синтез 72 С - 50 сек. После завершения 35 циклов амплификации проводят заключительный синтез при 72 С в течении 10 мин. В результате ПЦР амплифицировался фрагмент длиной 198 п.н. Рестрикционный анализ проводят в растворе,содержащем 1 ед., 1 мМ - рН 8.5, 1 мМ 2, 10 мМ КС 1, 0,1 мг/млпри 37 С в течение 12 часов. Продукты рестрикции подвергают электрофорезу в 8 ПААГ. При мутационной замене С на Т в 677 позиции образуется сайт рестрикции для данной рестриктазы, что позволяет идентифицировать этот аллельный вариант по наличию двух фрагментов в 178 п.н. и 20 п.н. В случае нормального аллельного варианта сайт дляв амплифицированном участке гена отсутствует, и после рестрикции размер фрагмента оставался 198 п.н. Частотное распределение аллелей и генотипов генаи ИАПГ-1 оценивают с помощью критериев 2. На основании полученных данных аллели Т и 5 генови ИАПГ-1, соответственно, у мужчин казахской национальности рассматривают как молекулярно-генетический маркер ранней диагностики артериальной гипертонии. Пример 1. Больной Ж., 1958 г. рожд., казах,поступил с жалобами на боли в затылочной части головы, шум в ушах, мелькание мушек перед глазами, общую слабость. Из анамнеза у мамы на фоне повышенного давления случился инсульт дважды. У больного взяли 5 мл венозной крови и выделили ДНК. Методом полимеразной цепной реакции с использованием олигонуклеотидных праймеров определили полиморфизмы генови ИАПГ 1. У больного выявлен генотип ТТ генаи генотип 55 гена ИАПГ-1, что дает возможность диагностировать артериальную гипертонию. Пример 2. Больной К., казах, 50 лет. Поступил с жалобами на боли в голове, головокружение,слабость. Отец на фоне повышенного давления перенес инсульт и умер в возрасте 55 лет. На Экг выраженная гипертрофия с систолической перегрузкой. У больного взяли 5 мл венозной крови,выделили ДНК и определили полиморфизмы генови ИАПГ-1. . При молекулярногенетическом анализе определили генотипы СТ генаи генотип 55 гена ИАПГ-1, что также дает возможность диагностировать артериальную гипертонию. Необходимость в этом исследовании возникла потому, что выяснение ассоциаций различных генотипов изученных генов с развитием АГ позволит получить сведения о группах больных,3 21812 имеющих различия в патогенетических механизмах развития этого заболевания. Пример 3. Пациент Ж., казах 44 лет. Жалоб не предъявляет. У пациента Ж. взяли 5 мл венозной крови,выделили ДНК и определили полиморфизмы генови ИАПГ-1. При молекулярно - генетическом анализе определили генотипы СС генаи генотип 44 гена ИАПГ-1, что не подтверждает генетическую предрасположенность к заболеванию. Пример 4. Пациент К., казах 38 лет. Жалоб не предъявляет. У пациента К. взяли 5 мл венозной крови,выделили ДНК и определили полиморфизмы генови ИАПГ-1. При молекулярно генетическом анализе определили генотипы СС генаи генотип 45 гена АПФ, что также не подтверждает генетическую предрасположенность к заболеванию. Заключительным этапом нашей работы явилось проведение анализа ген-генных взаимодействий совместного влияния генови ИАПГ-1 на риск развития артериальной гипертонии у мужчин казахской национальности. Были обследовано 120 мужчин, казахской национальности, поступивших в кардиологическое отделение ННМЦ г.Астаны с диагнозом артериальная гипертония 2-3 степени, риск 2-3, без сопутствующих заболеваний. Средний возраст больных составил 45,00,7 лет. В контрольную группу были включены 80 практически здоровых лиц без клинических проявлений сердечно-сосудистых заболеваний, без отягощенной наследственности по вышеуказанному заболеванию, с нормальными показателям ЭхоКГ,ЭКГ и нагрузочных проб, средний возраст которых составил 42,50,9. Нами проведен анализ совместного влияния генотипов исследованных генов на развитие АГ у лиц казахской национальности. Таблица Ген-генные взаимодействия генови ИАПГ-1 у лиц казахской национальности Группы Больные Здоровые Больные Здоровые Больные Здоровые В результате анализа ген-генного взаимодействия генотипов генаи ИАПГ-1 установлено, что сочетание генотипов ТТСТ генас генотипом 55 гена ИАПГ-1 встречается исключительно только у больных АГ. Тогда как данное сочетание у здоровых лиц не встречается. В то же время у практически здоровых лиц сочетание генотипа 44 гена ИАПГ-1 с генотипом ТТСТ генавстречается 8 раза чаще по сравнению с больными АГ (37,5 4,8 соответственно). Следовательно, наличие аллеля Т генав сочетании с гомозиготной аллелей 5 гена ИАПГ-1 встречается только у больных АГ. Напротив наличие аллеля 4 гена ИАПГ-1 в сочетании с аллелем Т генавстречается достоверно чаще у практически здоровых лиц казахской национальности (215,5 Р 0,05) Таким образом, в результате исследования выявлено прогностически неблагоприятное сочетание генотипов по генами ИАПГ-1 у мужчин казахской национальности. Одновременное сочетание аллеля 5 гена ИАПГ-1 с аллелем Т генаможно отнести к маркерам повышенного риска развития АГ в данной этнической группе, что указывает на наличие ген-генного взаимодействия в формировании наследственной предрасположенности к данному заболеванию, а проведение подобного анализа будет способствовать более полной информации о риске возникновения болезни. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ определения риска возникновения артериальной гипертонии путем проведения молекулярно-генетических исследований и определения полиморфизма генов, как генетического маркера заболевания, отличающийся тем, что используют кровь мужчин казахской национальности, из которой выделяют ДНК,проводят ее молекулярно-генетический анализ методом полимеразной цепной реакции, определяют полиморфизм генови ИАПГ-1, и при наличии аллеля Т генаи аллеля 5 гена ИАПГ-1 диагностируют предрасположенность к заболеванию артериальной гипертонии.