Способ диагностики окислительного стресса у больных артериальной гипертонией

(51) 01 33/48 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к медицине, а именно к терапии и кардиологии, и может быть использовано для диагностики окислительного стресса у больных артериальной гипертонией. При содержании общего количества перекиси более 440 мкмоль/л и общей антиокислительной активности менее 1,23 ммоль/л делают вывод о наличии окислительного стресса у больных артериальной гипертонией. Использование способа позволяет в короткие сроки с высокой специфичностью выявить у больных АГ признаки окислительного стресса, что дает возможность своевременно выявить группу больных высокого риска развития сердечно-сосудистых осложнений,нуждающуюся в проведении лечебнопрофилактических мероприятий.(72) Джусипов Алихан Казахпаевич Шлымова Райхан Олжабаевна Джунусбекова Гульнара Алдешовна Тундыбаева Мейрамгуль Капсиметовна(73) Республиканское государственное казенное предприятие Научно-исследовательский институт кардиологии и внутренних болезней Министерства здравоохранения Республики Казахстан(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА У БОЛЬНЫХ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТОНИЕЙ 21809 Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии и может быть использовано для диагностики окислительного стресса у больных артериальной гипертонией (АГ). Известен способ интегральной оценки окислительного стресса,заключающийся в исследовании крови с определением показателей свободнорадикальных реакций(диеновых конъюгатов, малонового диальдегида, степени окисленности общих липидов) и уровня эндогенных антиоксидантов (-токоферола, церулоплазмина) с последующим вычислением интегрального показателя (К), при этом увеличение К более 1,12 свидетельствует об усилении окислительного стресса (Патент РФ 2226276, кл. 01 33/48, опубл. 27.03. 2004). Недостатками данного способа являются сложность метода, состоящего из определения уровня пяти веществ и последующего вычисления интегрального показателя длительность исследования высокая стоимость реактивов. В качестве прототипа выбран способ диагностики окислительного стресса,заключающийся в исследовании в крови уровня белковых и небелковых серосодержащих компонентов анти/прооксидантной системы организма и малонового диальдегида с определением в гемолизате тиоловых групп. По разнице между показателями тиоловых групп гемолизата здоровых людей и обследуемого человека определяют количество дисульфидных групп и при значении этой разницы, равной 0,0000,008 оптических единиц, определяют отсутствие окислительного стресса. При положительном значении этой разницы дополнительно определяют количество промежуточных и минорных продуктов окислительной модификации биомолекул эритроцитов(КОМБэр) после предварительной химической индукции 2 процессов перекисного окисления. Чем выше значение КОМБэр., тем выше уровень окислительного стресса организма (Патент РФ 2236008, 01 33/48,опубл. 10.09.2004). Недостатками прототипа являются сложность и дороговизна метода вследствие необходимости определения уровня большого количества показателей, химической индукции процесса окисления, математических вычислений. Кроме того, способ отличается невысокой точностью и воспроизводимостью,т.к. основывается на определении косвенных маркероз окислительного стресса, на изменение которых могут влиять и внешние факторы. Задача изобретения - разработка способа диагностики окислительного стресса при артериальной гипертонии, повышающего точность,простоту диагностики и ускорение выявления окислительных процессов у больных артериальной гипертонией, с целью своевременного выявления группы пациентов с повышенным риском развития сердечно-сосудистых осложнений, нуждающихся в проведении лечебно-профилактических мероприятий. 2 Технический результат заявляемого способа состоит в обеспечении высокой точности и быстроты постановки диагноза. Кроме того,предлагаемый способ несложен и может служить методом экспресс-диагностики. Сущность предложенного способа диагностики окислительного стресса у больных артериальной гипертонией состоит в исследовании крови,согласно изобретению проводят определение общего количества перекиси и общей антиокислительной активности методом иммуноферментного анализа и при содержании общего количества перекиси более 440 мкмоль/л и общей антиокислительной активности менее 1,23 ммоль/л делают вывод о наличии окислительного стресса у больных артериальной гипертонией. В предложенном нами изобретении для диагностики окислительного стресса у больных артериальной гипертонией используют определение общего количества перекиси и общей антиокислительной активности в крови, как самостоятельных разнонаправленных диагностических критериев свободнорадикальных окислительных процессов. Окислительный стресс это нарушенный баланс между оксидантами и антиоксидантами в организме в виде избыточной продукции свободных кислородных радикалов или недостаточной антиоксидантной защиты,запускающий патологический процесс, который прямо или косвенно приводит к развитию серьезных заболеваний и осложнений. При артериальной гипертонии окислительный стресс может оказывать прямое повреждающее действие на органы-мишени головной мозг, сердце, сосуды, почки. Широкое использование способов диагностики, основанных на обнаружении эффектов,вызываемых свободными радикалами,либо определении продуктов перикисного окисления липидов,ограничено относительно сложными и недостаточно точными методами. Предлагаемый метод оценки окислительного стресса по содержанию общего количества перекиси и общей антиокислительной активности крови, является простым и быстрым способом комплексной характеристики свободнорадикальных окислительных процессов организма. Общее количество перекисей оценивает общую продукцию свободных радикалов, т.е. количество окисленных биологических молекул(белков, липидов и др.) и, следовательно,показывает прооксидантный статус обследуемого. Напротив, уровень общей антиокислительной активности, являясь естественной составляющей процессов защиты, оцениваемый по угнетению сывороткой крови свободных радикалов,генерируемых при окислении тетраметилбензидина с перекисью водорода, характеризует возможности адаптационно-компенсаторных механизмов организма. Способ осуществляют следующим образом. Для исследования производят забор венозной крови из локтевой вены в количестве 5 мл натощак. В качестве образцов для определения общего 21809 количества перекисей рекомендуется использовать плазму, для определения общей антиокислительной активности свежеприготовленную сыворотку. Содержание общего количества перекисей в плазме крови определяют с помощью набора ,фирмы , общей антиокислительной активности в сыворотке крови - с помощью набора ТАС, фирмыиммуноферментным твердофазным, неконкурентным методом, основанным на прямой сэндвич технологии методом. Стандартные кривые строят для каждого анализа в координатах - оптическая плотность против концентрации для каждого стандарта. При содержании общего количества перекиси в крови более 440 мкмоль/л и общей антиокислительной активности менее 1,23 ммоль/л делают вывод о наличии окислительного стресса у больных артериальной гипертонией. Предлагаемый способ диагностики окислительного стресса при артериальной гипертонии прошел клинические испытания при обследовании 20 практически здоровых добровольцев (1 группа) и 55 нелеченных больных АГ - степени, среднего и высокого риска (по классификации ВОЗ/МОАГ,1999 г.). Уровень общего количества перекиси в крови распределился в диапазоне от 160 мкмоль/л до 750 мкмоль/л (медиана раслределения - 440 мкмоль/л). Уровень общей антиокислительной активности распределился в диапазоне от 0,92 ммоль/л до 3,0 ммоль/л (медиана распределения 1,23 ммоль/л). По уровню общего количества перекиси и общей антиокислительной активности пациенты с АГ были распределены на 2 группы 1 группа - 21 больных с уровнем общего количества перекиси меньше 440 мкмоль/л и общей антиокислительной активности более 1,23 ммоль/л 2 группа - 34 больных с уровнем общего количества перекиси более 440 мкмоль/л и общей антиокислительной активности менее 1,23 ммоль/л. В крови также определяли спектрофотометрически содержание первичных продуктов перикисного окисления липидов - диеновые, триеновые,оксодиеновые и тетраеновые конъюгаты колориметрически содержание вторичных продуктов перикисного окисления липидов,реагирующих с тиобарбитуровой кислотой(малонового диальдегида). После щелочного гидролиза образцов спектрофотометрически определяли содержание жирорастворимых витаминов А, Е, каротиноидов. Для проведения статистического анализа в исследованных группах использована программа статистической обработки информации 6,0 (, , 2006). Вычисляли среднюю и ошибку средней (М). Сравнение осуществлялось с помощью критериев Стьюдента(сравнение средних). Уровень достоверности оценивался значением р. Различия при сравнении считались достоверными с вероятностью более 95 при р 0,05. Данные комплексного клинического и биохимического обследования у больных АГ в зависимости от общего количества перекиси,общей антиокислительной активности и в контрольной группе представлены в таблице. Таблица Данные клинического и биохимического обследования у больных АГ в зависимости от общего количества перекиси, общей антиокислительной активности и в контрольной группе Показатели Общее количество перекиси, мкмоль/л Антиоксидантная способность, ммоль/л Возраст Длительность АГ Исх. клиническое давление (мм ) Систолическое Диастолическое Диеновые коньюгаты, мкмоль/мл 0,270,06 0,390,03 0,450,06 Триеновые конъюгаты, мкмоль/мл 0,90,05 0,120,03 0,190,01 Оксодиеновые конъюгаты мкмоль/мл 0,0220,02 0,180,06 0,240,03 Малоновый диальдегид, мкмоль/мл 0,160,01 11,51,3 20,71,9 Витамин Е, мкмоль/мл 0,170,02 0,220,03 0,250,04 Витамин А, мкмоль/мл 0,0070,001 0,0080,001 0,0090,002 Каротин, мкмоль/мл 0,030,005 0,140,09 0,210,05 Примечание- различия значимы (р 0,05) при сравнении больных АГ 1 группы с контролемразличия значимы при сравнении больных АГ 2 группы первой группы с контролем- при сравнении первой и второй групп больных АГ. В ходе комплексного клинического и биохимического обследования у больных АГ 1 группы не выявлено признаков окислительного стресса, у пациентов 2 группы отмечены признаки повышения активности окислительных процессовнакопление первичных продуктов перикисного обмена липидов - преобладания уровня диеновых и триеновых коньюгантов, при этом ускорен распад продуктов трансформации полиненасыщенных 3 21809 жирных кислот до диальдегидных продуктов с повышением уровня малонового диальдегида. Полученный диагностический критерий по уровням общего количества перекиси и общей антиокислительной активности в крови был полностью подтвержден клинико-биохимическим обследованием Приводим примеры. Пример 1. Пациент Т., 1949 года рождения. Около пяти лет страдает артериальной гипертонией с максимальными цифрами АД 160/90 мм рт.ст. Из анамнеза отсутствуют указания на хронические и острые воспалительные заболевания. Вторичный характер гипертонии при комплексном обследовании исключен. Уровень общего количества перекиси в плазме крови составил 321 мкмоль/л (ниже 440 мкмоль/л) уровень общей антиокислительной активности - 2,5 ммоль/л (выше 1,23 ммоль/л) что указывает на отсутствие окислительного стресса у данного больного артериальной гипертонией. Пример 2. Пациентка Д., 1957 года рождения. Около десяти лет страдает артериальной гипертонией с максимальными цифрами А 190/100 мм рт.ст. Из анамнеза отсутствуют указания на хронические и острые воспалительные заболевания. Вторичный характер гипертонии при комплексном обследовании исключен. Уровень общего количества перекиси в плазме крови составил 520 мкмоль/л (выше 440 мкмоль/л) уровень общей антиокислительной активности - 0,98 ммоль/л (ниже 1,23 ммоль/л) что указывает на наличие окислительного стресса у данного больного артериальной гипертонией. По приведенным выше примерам видно, что у больных артериальной гипертонией с высокой активностью свободнорадикальных окислительных процессов отмечается преобладание прооксидантный статуса со снижением уровня общей антиокислительной активности. Таким образом, у больных АГ наличие окислительного стресса сопровождается изменением уровня общего количества перекисей и общей антиоксидантной активности в крови, что позволяет рассматривать данные показатели,как диагностические маркеры свободнорадикального процесса при артериальной гипертонии. Использование предложенного метода имеет следующие преимущества 1) высокая специфичность в диагностике окислительного стресса при артериальной гипертонии 2) быстрая диагностика 3) обеспечивает возможность своевременного и рационального проведения комплекса терапевтических мероприятий. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ ранней диагностики окислительного стресса у больных артериальной гипертонией путем исследования крови, отличающийся тем, что в крови определяют содержание общего количества перекиси и общей антиоксидантной способности методом иммуноферментного анализа,при содержании общего количества перекиси более 440 мкмоль/л и общей антиокислительной активности менее 1,23 ммоль/л делают вывод о наличии окислительного стресса у больных артериальной гипертонией.