Способ получения иммуноглобулина А из сыворотки крови крупного рогатого скота

(51) 61 39/395 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ использовано для выделения иммуноглобулина А высокой чистоты. Способ получения иммуноглобулина А из сыворотки крови крупного рогатого скота включает выделение иммуноглобулина из сыворотки крови с помощью неорганического вещества - раствора сернокислого аммония, после чего выделенный иммуноглобулин подвергают гель-фильтрации на сефадексе -200 и препаративному электрофорезу в агаровом геле. Чистота полученного белка доказана электрофорезом,иммуноэлектрофорезом и специфическим истощением иммунной сыворотки.(76) Джанабекова Гульмира Кумискалиевна ,Жумашев Жайгали Жумашевич , Несипбаева Айгуль Кадыровна , Божбанов Алихан Жексенбиевич(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНА А ИЗ СЫВОРОТКИ КРОВИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 21308 Изобретение относится к биологической химии,а точнее к биотехнологии, и может быть использовано для выделения иммуноглобулина А высокой чистоты. Иммуноглобулин А является одним из важнейших защитных белков сыворотки крови,содержащий различные антитела. Иммуноглобулины класса А главным образом защищают слизистые желудочно-кишечного тракта, дыхательных, мочеполовых путей и глаз. В этой фракции находятся антитела против инсулина и тиреоглобулина, а также дифтерийные и столбнячные антитоксины. Выделение иммуноглобулина А из сыворотки крови представляет большие сложности, что объясняется следующими основными причинами а) высокая м. м., равная 1 000000 б) сложная организация его молекулы, состоящая из 5 субъединиц,связанных лабильными дисульфидными связями в) относительно низкая концентрация этого белка в нормальных сыворотках крови человека и животных, не превышающих 2-4 от общего белка г) трудностью его точной идентификации д) присутствием в сыворотке крови,по крайней мере, 3 белков, сильно препятствующих выделению иммуноглобулина А альфамакроглобулин, бета-липопротеид и димерные или полимерные формы иммуноглобулина А. Прототипом является способ выделения иммуноглобулина А из сыворотки крови человека(а.с. СССР 1732518, кл. А 61 К 39/395, 1996), по которому препараты крови обрабатывают гексаном,осаждают 6-ным раствором полиэтиленгликоля 6000,с последующей хроматографией с использованием 6-ной иммунодиуксусной или надуксусной агарозе в цинковой форме и с помощью 6-ной поперечно-сшитой агарозы. После чего целевой продукт подвергают лиофилизации. Однако способ обеспечивает получение иммуноглобулина А лишь 95 чистоты. Задачей изобретения является разработка способа получения иммуноглобулина А из сыворотки крови крупного рогатого скота, позволяющего получить высокоочищенный препарат иммуноглобулина А, пригодный для биохимических исследований - аминокислотного анализа, приготовления различных стандартов с иммуноглобулином А, получения моноспецифических иммунных сывороток. Способ получения иммуноглобулина А из сыворотки крови крупного рогатого скота включает выделение иммуноглобулина из сыворотки крови с помощью неорганического вещества - раствора сернокислого аммония, после чего выделенный иммуноглобулин подвергают гель-фильтрации на сефадексе -200 и препаративному электрофорезу в агаровом геле. Пример. Для выделения иммуноглобулина А используют препараты белков,полученные осаждением нормальной сыворотки крови 4 М раствором (4)2 4, а именно надосадочную жидкость после удаления эуглобулиновой фракции (диализ против 2 0,002 М фосфатного буфера рН 6,3). Процесс приготовления иммуноглобулина А из надосадочной жидкости состоит из трех этапов осаждения сернокислым цинком, хроматографии на ДЭАЭ - седафексе А - 50 и препаративного электрофорез в агаровом геле а) Осаждение 0,2 М 4. Получение предварительно очищенного белка,обогащенногопроводят по описанию Хереманса и др. Надосадочную жидкость после удаления.разбавляют равным объемом 1,2 М раствора 4 рН раствора сразу же доводят до 6,95 с помощью 10 раствора углекислого натрия. После перемешивания в течение часа осадок удаляют центрифугированием. В надосадочную жидкость добавляют ЭДТА до 1 концентрации и перемешивают в течение часа. В прозрачный раствор добавляют равный объем 4 М раствора и перемешивают. Осадок диализуют и подвергают исследованию электрофорезом и иммуноэлектрофорезом. Электрофоретическое и иммуноэлектрофоретическое изучение полученного препарата показало, что он представляет собой в основном смесь трех белков - 1, 2, . б) Хроматография на ДЭАЭ -сефадексе А-50. С целью полученияА хроматографию на ДЭАЭ - сефадексе А-50 проводят следующим образом 10 г ДЭАЭ- сефадекса А -50 суспендируют в воде и удаляют мелкие частицы как описано выше. Гель по воронке Бюхнера промывают сначала 2 л 0,5 и НС 1, дистиллированной водой до рН 4,0-4,2,затем 2 л 0,5 н , дистиллированной водой до рН 8,0 и насыщают 0,01 М раствором калийфосфатного буфера, рН 6,0. Суспензию ДЭАЭ-сефадекса А-50 смешивают с раствором белка(полученного 4) и перемешивают с помощью магнитной мешалки в течение часа в холодильнике и переливают на воронку Бюхнера. Промывку геля ДЭАЭ- сефадекса А-50 в холодильнике холодным раствором калийфосфатного буфера проводят в следующей последовательности и выделяемый белок контролируют электрофорезом и иммуноэлектрофорезом. При промывке геля 0,01 М раствором фосфатного буфера, рН 8,0 (300 мл) вымывается в основном 2. При промывке геля 0,04 М раствором указанного буфера, рН 8,0 (250 см 3) также вымывается 2 со значительной примесью 1. При промывке геля 0,04 М раствором фосфатного буфера, рН 7,5 (200 см 3) вымывается в основном 1 со следами 2. При промывке геля 0,20 М раствором фосфатного буфера ,рН 7,5 выходит смесь белков,состоящий изА и 1 (28 и 72), без примесей других белков. Повторная хроматография полученного препарата на ДЭАЭ-сефадексе А-50 полностью не удаляет примесей 1. в) препаративный электрофорез в агаровом геле. Указанным методом не удается выделить чистый иммуноглобулин А, препарат содержит примесь 1, поэтому для удаления примеси 1 и для 21308 получения чистогоА используют препаративный электрофорез в агаровом геле. При этом зонаА четко и достаточно далеко отделяется от зоны 1 в результате чего становится возможным выделение чистого препарата. Чистые препараты иммуноглобулина А используются для различных биохимических исследований и прежде всего для получения моноспецифических иммунных сывороток, которые нужны для диагностики инфекционных заболеваний, качественного и количественного определения иммуноглобулинов в крови, молозиве,молоке и других жидкостях организма. 3 21308 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения иммуноглобулина А из сыворотки крови крупного рогатого скота,включающий выделение иммуноглобулина из сыворотки, отличающийся тем, что выделение иммуноглобулина из сыворотки крови осуществляют с помощью раствора сернокислого аммония,а выделенный иммуноглобулин подвергают гель-фильтрации на сефадексе -200 и сепаративному электрофорезу в агаровом геле.