Способ получения иммуноглобулина М из сыворотки крови крупного рогатого скота

(51) А 61 К 39/395 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ использовано для выделения иммуноглобулина М высокой чистоты. Способ получения иммуноглобулина М из сыворотки крови крупного рогатого скота, включает выделение иммуноглобулина из сыворотки крови с помощью неорганического вещества - раствора сернокислого аммония, после чего выделенный иммуноглобулин подвергают гель-фильтрации на сефадексе -200 и сепаративному электрофорезу в агаровом геле. Чистота полученного белка доказана электрофорезом,иммуноэлектрофорезом и специфическим истощением иммунной сыворотки.(76) Джанабекова Гульмира Кумискалиевна ,Жумашев Жайгали Жумашевич , Салханова Сауле Насибеденовна , Кенжеев Шукирхан Толенович , Джунусова Райхан Жексенбаевна(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНА М ИЗ СЫВОРОТКИ КРОВИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 21309 Изобретение относится к биологической химии,а точнее к биотехнологии, и может быть использовано для выделения иммуноглобулина М высокой чистоты. Иммуноглобулин М является одним из важнейших защитных белков сыворотки крови,содержащий различные антитела. Выделение иммуноглобулина М из сыворотки крови представляет большие сложности, что объясняется следующими основными причинами а) высокая М. м., равная 1 000000 б) сложная организация его молекулы, состоящая из 5 субъединиц,связанных лабильными дисульфидными связями в) относительно низкая концентрация этого белка в нормальных сыворотках крови человека и животных, не превышающих 2-4 от общего белка г) трудностью его точной идентификации д) присутствием в сыворотке крови,по крайней мере, 3 белков, сильно препятствующих выделению иммуноглобулина М альфамакроглобулин, бета-липопротеид и димерные или полимерные формы иммуноглобулина А. Прототипом является способ выделения иммуноглобулина М из сыворотки крови человека(а.с. СССР 1732518, кл. А 61 К 39/395, 1996), по которому препараты крови обрабатывают гексаном,осаждают 6-ным раствором полиэтиленгликоля 6000,с последующей хроматографией с использованием 6 -ной иммунодиуксусной или надуксусной агарозе в цинковой форме и с помощью 6-ной поперечно-сшитой агарозы. После чего целевой продукт подвергают лиофилизации. Однако способ обеспечивает получение иммуноглобулина М лишь 95 чистоты. Задачей изобретения является разработка способа получения иммуноглобулина М из сыворотки крови крупного рогатого скота,позволяющего получить высокоочищенный препарат иммуноглобулина М, пригодный для биохимических исследований - аминокислотного анализа, приготовления различных стандартов с иммуноглобулином М,получения моноспецифических иммунных сывороток. Способ получения иммуноглобулина М из сыворотки крови крупного рогатого скота, включает выделение иммуноглобулина из сыворотки крови с помощью неорганического вещества - раствора сернокислого аммония, после чего выделенный иммуноглобулин подвергают гель-фильтрации на сефадексе -200 и сепаративному электрофорезу в агаровом геле. Пример. К охлажденной сыворотке крови овцы добавляют равный объем холодного 4 М раствора сульфата аммония, смесь перемешивают в холодильнике в течение 30 мин с помощью магнитной мешалки. Осадок удаляют центрифугированием при 5000 об/мин в течение 20 мин. Осадок растворяют в физиологическом растворе и снова осаждают 4 М раствором сульфата аммония. Переосаждение повторяют еще 2 раза. Полученный 4 М раствором сульфата аммония осадок глобулинов растворяют в физиологическом растворе и диализуют против этого раствора в 2 течение суток при трехкратной смене физраствора. Затем диализ продолжают против 0,002 М раствора фосфатного буфера, рН 6,3 в течение двух суток,при ежедневной трехкратной смене буферного раствора. Полученный осадок эуглобулина удаляют центрифугированием, растворяют в физрастворе и подвергают гель-фильтрации. Гель-фильтрацию на сефадексе -200 проводят в 0,05 М трис-НС 1 буфере, рН 8,2, содержащий 0,1 М хлористый натрий, собирая первый пик. Для получения высокоочищенного иммуноглобулина М содержимое первого пика подвергают препаративному электрофорезу, для чего применяются корсаковский агар и электрофоретическая камера,сделанная из плексигласа. В качестве буферного раствора применяется боратно-ацетатный буфер следующего состава ацетат натрия - 43,56 г, борная кислота 52,56 г, бура - 76,28 г на 10 л воды. Все реактивы марки ХЧ. рН такого раствора - 8,57. Электрофорез проводится следующим образом. Гель заливается толщиной около 1 см, а раствор белка в количестве 20 мл разбавляют 10 мл 2 раствора агара и заливают в сплошную траншею. Поверхность траншеи заплавляют 2 агаром. Электрофорез проводят в течение 6 часов, при напряжении 220 В, силе тока 220-240 мА в холодильнике. Сегмент геля, соответствующий зоне иммуноглобулина М замораживают в морозильнике холодильника,оттаивают при комнатной температуре и используют как препарат иммуноглобулина М. Чистота выделенного иммуноглобулина М проверялась электрофорезом в агаровом геле, где была получена чистая фракция иммуноглобулина М. Иммуноэлектрофорезом получена четкая,единственная линия чистого белка иммуноглобулина М. Полученные результаты показаны на чертеже, где- электрофоретическое изучение иммуноглобулина М крупного рогатого скота 1. Предварительно очищенный белок 2. Чистый иммуноглобулин М- иммуноэлектрофоретическое изучение иммуноглобулина М 1. иммуноглобулин М 2. Антисыворотка к белкам крупного рогатого скота- изучение иммуноглобулина М методом истощения иммунной сыворотки 1. Сыворотка крови крупного рогатого скота 2. Препарат чистого иммуноглобулина М а) антисыворотка к белкам барана в) антисыворотка к белкам крупного рогатого скота истощенная иммуноглобулинами классаи альбумином. Чистые препараты иммуноглобулина М используются для различных биохимических исследований и прежде всего для получения моноспецифических иммунных сывороток, которые нужны для диагностики инфекционных заболеваний, качественного и количественного 21309 определения иммуноглобулинов в крови, молозиве,молоке и других жидкостях организма. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ сыворотки получения иммуноглобулина крови крупного рогатого М из скота, включающий выделение иммуноглобулина из сыворотки, отличающийся тем, что выделение иммуноглобулина из сыворотки крови осуществляют с помощью раствора сернокислого аммония,а выделенный иммуноглобулин подвергают гель-фильтрации на сефадексе -200 и сепаративному электрофорезу в агаровом геле.