Биопрепарат “Энтерокол”, способ его получения, способ профилактики кишечных инфекций молодняка сельскохозяйственных животных и птиц

(51) 61 35/74 (2011.01) 12 1/20 (2011.01) 12 1/04 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ биопрепарата используют штамм 64,являющегося представителем нормальной микрофлоры кишечника животных и птиц. Способ получения биопрепарата Энтерокол включает культивирование штамма в питательной среде, концентрирование, расфасовку во флаконы и лиофилизацию, при этом в качестве основы биопрепарата используют штамм 64. Способ профилактики кишечных инфекций молодняка сельскохозяйственных животных и птиц включает однократное пероральное введение биопрепарата Энтерокол, причем препарат вводят телятам в дозе - 41010 КОЕ, ягнятам - 1010 КОЕ,поросятам - 1010 КОЕ до первого кормления не позднее 30 минут после рождения. Полученный биопрепарат Энтерокол обладает широким диапазоном антимикробного действия и высокой антагонистической активностью, повышает эффективность профилактики кишечных инфекций молодняка сельскохозяйственных животных и птиц.(72) Бияшев Кадыр Бияшевич Ермагамбетова Светлана Емлсовна Киркимбаева Жумагуль Слямбековна Бияшев Биржан Кадырович(54) БИОПРЕПАРАТ ЭНТЕРОКОЛ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ,СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ МОЛОДНЯКА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ И ПТИЦ(57) Изобретение относится к области ветеринарии,в частности, к получению бактериального препарата для профилактики желудочно-кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных и птиц. Биопрепарат Энтерокол содержит лиофильно высушенную сухую массу из непатогенного штамма кишечной палочки, при этом в качестве основы Изобретение относится к области ветеринарии, в частности, к получению бактериального препарата для профилактики желудочно-кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных и птиц. Желудочно-кишечные болезни наносят огромный ущерб животноводству вследствие высокой заболеваемости и падежа, затрат на лечебные мероприятия, снижения продуктивных качеств и племенной ценности животных, хотя в современных рыночных условиях ведения отрасли не представляется возможным оценить реальные масштабы экономических потерь, связанных с нарушением микроэкологии желудочно-кишечного тракта. В настоящее время на вооружении ветеринарной службы многих стран имеется достаточное количество пробиотических препаратов различного видового состава,предназначенных для профилактики желудочно-кишечных болезней молодняка животных и птицы. Однако мониторинг рынка пробиотиков показывает,что подавляющее большинство разработок не востребованы практикой. Указанное обстоятельство дает основание предполагать, что протективная активность многих пробиотических препаратов не обеспечивает заявляемого авторами эффекта. Реальная потребность в экологически безопасных препаратах для профилактики желудочно-кишечных болезней,кажущаяся простота композиции пробиотика и снижение требований к содержанию и оформлению результатов научных и производственных испытаний привели к тому, что практически каждый научный или околонаучный коллектив считает способным реализовать себя в разработке пробиотических препаратов. Разумеется, каждая научная школа имеет право использовать свои подходы и методы к разработке профилактических и лечебных препаратов. Вместе с тем низкая эффективность некоторых пробиотических препаратов может быть обусловлена тем,что разработчики часто пренебрегают некоторыми важными критериями селекции пробиотических штаммов. Следует отметить, что в состав большинства пробиотиков входят штаммы, выделенные из кишечника человека или взятые из коллекции штаммов для пищевой биотехнологии. Это касается штаммов . , . , . , ., . , . , .и др. Необходимо учитывать, что бифидо- и лактобактерии,так же как и другие микроорганизмы,не все одинаковы. Род бифидобактерии, например, объединяет 24 вида микроорганизмов. Род лактобактерий еще больше. Одни виды обитают только у животных определенных видов, другие - у животных многих видов, третьи - у животных и человека, четвертые только у человека. Соответственно способность заселять кишечник у человека, животных или птиц различна. При селекции штаммов для пробиотиков 2 необходимо обязательно учитывать эти и многие другие биологические свойства. Поэтому физиологическая активность и эффективность разных препаратов зависят от состава штаммов,технологии производства. Накопленный фактический материал и многочисленные публикации в зарубежных странах,2004 и др.) свидетельствуют, что при отборе культур для приготовления пробиотиков следует помнить,что они должны удовлетворять определенным требованиям являться нормальными обитателями желудочно-кишечного тракта здоровых животных,быть непатогенными и нетоксичными, поскольку использование других бактерий может привести к непредвиденным эффектам- быть метаболически активными в экосистеме рубца, переносить пассаж через желудок и метаболизировать в кишечнике моногастричных животных и птицы, увеличивая их рост или резистентность к заболеванию- обладать способностью к адгезии на эпителии и приживлению в пищеварительном тракте, где ферментативная активность,связанная с перевариванием корма высокая, а среда агрессивная- быть стабильными и способными длительное время оставаться жизнеспособными при хранении в производственных условиях. Известно, что для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний применяют называемые пробиотические препараты бифидумбактерин,лактобактерий,споролакт,бификол, СБА активным началом, которых является клетки живых бактерий - представители нормальной микрофлоры кишечника (Патент РФ 2018313, кл. 12 1/20, 1994). Недостатком этих препаратов является то, что они имеют недостаточно широкий диапазон антимикробного действия и обладают невысокой антагонистической активностью, вследствие чего они недостаточно эффективны в лечении и профилактике заболеваний,широко распространенных среди новорожденного молодняка животных и птиц. Кроме того, при их культивировании получаются недостаточно высокие выходы составляющих их культур,свидетельствующие о их невысокой продуктивности. В основном эти препараты предназначены для лечения и профилактики дисбактериоза кишечника у людей и выпускаются в дозах, рассчитанных на них. Задачей изобретения является создание нового препарата -пробиотика Энтерокол, обладающего широким диапазоном антимикробного действия и более высокой антагонистической активностью,способа получения препарата и способа лечения и профилактики кишечных инфекций молодняка сельскохозяйственных животных и птиц. Биопрепарат Энтерокол содержит лиофильно высушенную сухую массу из непатогенного штамма кишечной палочки, при этом в качестве основы биопрепарата используют штамм 64 являющегося представителем нормальной микрофлоры кишечника животных и птиц. Способ получения биопрепарата Энтерокол включает культивирование штамма Е.64 в питательной среде, концентрирование, расфасовку во флаконы и лиофилизацию. Способ лечения и профилактики кишечных инфекций молодняка сельскохозяйственных животных и птиц включает однократное пероральное введение БиопрепаратаЭнтерокол новорожденным телятам, ягнятам, поросятам,цыплятам до первого кормления, не позднее 30 минут после рождения, в дозах телятам - 40.109 КОЕ ягнятам - 1010 КОЕ поросятам -1010 КОЕ и цыплятам - 109 КОЕ. Штамм 64 получен направленной селекцией выделенной культуры от здоровых ягнят. Штамм 64 депонирован в Национальном центре по биотехнологии Республики Казахстан Научно-исследовательский сельскохозяйственный институт под номером 4595 и получено заключение на штамм Е.64. Штамм 64 характеризуется следующими биологическими свойствами является представителем нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта здоровых животных- активен в экосистеме желудочно-кишечного тракта животных, переносит пассаж через желудок и метаболизируется в кишечнике увеличивая рост и резистентность к заболеванию- обладает способностью к адгезии на эпителии и приживанию в пищеварительном тракт- является стабильным и способен оставаться жизнеспособным в производственных условиях. Пример 1. Изготовление препарата. Штамм 64 засевают для получения матровой расплодки по 1 мл в два флакона с бульоном Хоттингера (объем среды 100 мл). Культуру выращивают в термостате 16-18 ч при 3738 С (культура первичной генерации). Культуру первичной генерации проверяют на чистоту микроскопией мазков, окрашенных по Граму и засевают 50 мл в бутыль, содержащую 10 л бульона Хоттингера, и культивируют 18-20 часов при 37 С (культура второй генерации). После проверки культуры второй генерации на чистоту и типичность роста выращивание культуры производят в АКМ-Ш(аппарат для культивирования микроорганизмов). С этой целью в АКМ-Ш, содержащий питательную среду в количестве 100-110 л, имеющую рН 7,6-7,8 в содержащую 200-250 мгаминного азота,перекачивают матриксную культуру в объеме 8-10 л, которую распределяют по кюветам путем вращения аппарата и его лепестков. После 15-20 мниутной выдержки посевного материала на кюветах излишек его сливают в бутыль. Выращивание культуры в аппарате производят в течение 16-18 ч под контролем приборов автоматики при температуре 37-38 С с 15-минутной аэрацией. После указанного срока выращивания бактериальной культуры в аппарат вводят стерильную смываемую жидкость(среду высушивания) в объеме 5-6 л и производят смыв путем вращения аппарата и его лепестков. Среда высушивания содержит 1.5-2 желатина, 10 сахарозы,среды -7,8-8,0. После проверки полученной микробной массы на чистоту и типичность роста ее доводит до концентрации 1010 К.О.Е. в 1 мл по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Тарасевича. Проверенную на стерильность,препарат расфасовывают в стерильные флаконы по 4 мл. Расфасовку препарата во флаконы проводят при непрерывном помешивании. Флаконы закрывают колпачками,подвергают замораживанию и высушиванию. День окончания лиофилизации считается датой изготовления препарата. Продолжительность сушки - 70-76 часов. После сушки флаконы с препаратом подают на закрутку колпачков. После закрытия флаконов проверяют визуально на отсутствие посторонней примеси,следов оттаивания, а при помощи аппарата ДАрсонваля определяют наличие вакуума во флаконах и этикируют. Пример 2. Контроль препарата. Препарат проверяют на чистоту и типичность роста, безвредность и активность. Для определения чистоты и типичности роста используют 5 флаконов с препаратом. Содержимое каждого флакона разводят в 4 мл стерильного физиологического раствора. Проводят посев по 0,2 мл из каждого флакона на МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом, на агар Эндо. Через 24 часа на МПА в чашках Петри должен быть типичный рост полупрозрачных круглых колоний серого цвета с ровными краями штамма 64, на среде Эндо колонии малиново-красного цвета, в МПБ- равномерное помутнение. Препарат не должен содержать посторонней микрофлоры. Питательные среды с посевом выдерживают в течение 10 суток при температуре 37-38 С. Безвредность каждой серии препарата проверяют на 10 белых мышах массой 14-16 г, которым препарат вводят перорально, в дозе 107 КОЕ в объеме 0,2 мл. Для испытания используют два флакона препарата. Препарат считают безвредной,если в течение 10 суток наблюдения все подопытные белые мыши остаются живыми. Активность препарата проверяют на 10 белых мышах массой 14-16 г, которым препарат вводят перорально в дозе 107 КОЕ в объеме 0,5 мл. Спустя 24 часа всем подопытным (10) и 10 контрольным белым мышей вводят перорально вирулентную культуру Е.в смертельных дозах. Препарат считают активной при выживании всех подопытных и гибели не менее 8 контрольных мышей. Срок наблюдения 10 суток. Пример 3. Определение профилактической эффективности. Определение профилактической эффективности препарата из штамма Е.64 проводили на 3 новорожденных телятах, ягнятах, поросятах и цыплятах путем однократной пероральной выпойкой животных в соответствующих дозах(таб.1). Спустя 24 часа опытным и контрольным животным вводили перорально вирулентную культуру в оттитрованной смертельной дозе. Результаты приведены в таблице 1. Как видно из данных табл. 1, оптимальной эффективной профилактической дозой препарата является 41010 К.О.Е. для телят, для ягнят - 1010 КОЕ, для поросят 1010 КОЕ. и цыплят - 109 КОЕ. Пример 4. Определение лечебной эффективности. Определение лечебной эффективности препарата из штамма Е.64 проводили на новорожденных телятах, ягнятах, поросятах и цыплятах. В начале подопытным животным вводили однократно перорально вирулентные культуры сальмонелл,протеи, клебсиел, бацилл в инфекцинирующих дозах (таб.2). На 3 сутки после введения вирулентных культур опытным животным вводили перорально однократно биопрепарат Энтерокол. Контрольные животные препарат не получали. Результаты приведены в таблице 2. Как видно из данных табл.2 биопрепарат Энтерокол обладает высокой лечебной эффективностью. Пример 5. Применение биопрепарта Энтерокол Препарат применяют с профилактической целью в хозяйствах, неблагополучных по желудочнокишечным заболеваниям, вызванным патогенными микробами кишечной группы. Биопрепарат Энтерокол показан новорожденным животным и птицам до первого кормления не позднее 30 минут после рождения. Препарат применяют однократно,перорально в дозах телятам - 41010 КОЕ, ягнятам 1010 КОЕ, поросятам -1010 КОЕ, цыплятам - 109 КОЕ.При необходимости рекомендуется повторное применение препарата через 3-5 суток. Срок годности препарата Энтерокол - 1 год со дня изготовления при условии хранения в сухом темном помещении при температуре 4-15 С. Биопрепарат Энтерокол безвреден для молодняка сельскохозяйственных животных и птиц. Препарат апробирован в ряде хозяйств Республики Казахстан. Профилактическая эффективность препарата составляет 95-100. Ожидаемый ежегодный экономический эффект от использования препарата Энтерокол составляет в среднем 60-80 тенге на один затраченный тенге. Полученный биопрепарат Энтерокол обладает широким диапазоном антимикробного действия и высокой антагонистической активностью, повышает эффективность лечения и профилактики кишечных инфекций молодняка сельскохозяйственных животных и птиц. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Биопрепарат для профилактики кишечных инфекций молодняка сельскохозяйственных животных и птиц, содержащий лиофильно высушенную сухую массу из непатогенного штамма кишечной палочки, отличающийся тем, что в качестве основы биопрепарата используют штамм 64 2. Способ получения биопрепарата, включающий культивирование штамма в питательной среде,концентрирование, расфасовку во флаконы и лиофилизацию, отличающийся тем, что проводят культивирование штамма 64 3. Способ профилактики кишечных инфекций молодняка сельскохозяйственных животных и птиц,включающий однократное пероральное введение биопрепарата, отличающийся тем, что биопрепарат вводят телятам в дозе 41010 КОЕ, ягнятам - 1010 КОЕ, поросятам 1010 КОЕ, цыплятам - 109 КОЕ до первого кормления, не позднее 30 минут после рождения