Способ получения антигена из дерматомицетов для серологической диагностики

(51) 01 33/53 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ подвергается водно-фенольной экстракции при 6568 С 1 час и при минус 18 С в течение суток с целью максимального освобождения от полисахаридов. Обработанная биомасса ресуспендируется цитратным буфером из расчета 2 мл на 1 г клеток и инкубируется в течение 16-20 часов при температуре 37 С при постоянном перемешивании, после чего центрифугируется в течение 20 минут при 3000 об/мин. Надосадочная жидкость(супернатант) сливается и центрифугируется повторно 20 мин при 3000 об/мин. Полученный антиген характеризуется высоким содержанием белка,наличием преципитирующих свойств при постановке реакции преципитации, высокой активностью и достаточной специфичностью в иммуноферментном анализе. Предлагаемый способ позволяет получить белковый антиген для иммуноферментного анализа при серологической диагностике трихофитии крупного рогатого скота, который не уступает по чувствительности полисахаридному антигену,полученному известным способом по Вестфаль-Яну. Использование предлагаемого способа позволит получить активный и специфичный антиген с целью использования в иммуноферментном анализе для серологической диагностики трихофитии крупного рогатого скота, имеющий простую технологию производства, высокий выход антигена с 1 г биомассы и легкость в стандартизации по содержанию белка.(72) Кухар Елена Владимировна Муканов Касым Касенович Акимбаева Айнур Курманбековна Киян Владимир Сергеевич Щурихин Борис Григорьевич Пак Михаил Евгеньевич(73) Акционерное общество Казахский агротехнический университет им. Сакена Сейфуллина(56) Кухар Е.В, и др. Использование иммуноферментной тест-системы в диагностике трихофитии крупного рогатого скота. Естествознание и гуманизм, 2005, с.1-5 Ф.ГЕРХАРДТ. Методы общей бактериологии,М. МИР, 1984, с.331-332(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ИЗ ДЕРМАТОМИЦЕТОВ ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ(57) Изобретение относится к области ветеринарии,а именно к диагностике инфекционных болезней животных. Технической задачей способа является разработка технологии получения активного и специфичного антигена с целью использования в серологической диагностике трихофитии крупного рогатого скота, которая достигается тем, что при получении антигена двухнедельная культура дерматомицета отделяется от жидкой питательной среды фильтрованием через бумажный фильтр,отмывается от культуральной жидкости и 24309 Изобретение относится к ветеринарии, а именно к диагностике инфекционных болезней животных. В ветеринарной практике до настоящего времени не разработаны высокоэффективные способы и средства серологической диагностики дерматомикозов, что связано со сложностью приготовления и стандартизации грибных антигенов, необходимых для постановки реакции. Грибы богаче полисахаридами, чем белками,поэтому чаще всего в качестве антигенов при микозах используются полисахариды, технологии получения которых общеизвестны(Методы экспериментальной микологии. Справочник. Киев. Наукова думка, 1982, с.406-414 Курасова В.В.,Костин В.В.,Малиновская Л.С. Методы исследования в ветеринарной микологии. М. Колос. 1971, с.123-129). Среди веществ определенной химической природы наиболее активными иммуногенами или сильными антигенами являются белки (Елинов Н.П. Химическая микробиология. М. Высшая школа,1989, с.389). Для использования в РА, РСК и РП антигены с преимущественным содержанием белковых компонентов получают экстракцией клеток гриба 0,14 М раствором хлористого натрия (Курасова В.В.,Костин В.В.,Малиновская Л.С. Методы исследования в ветеринарной микологии. М. Колос, 1971, с.129-130). Так же белковые компоненты различных грибов для серологических реакций и аллергической диагностики получают экстракцией фосфатнобуферным раствором. (Дроздов А.И., Васильев О.Д.,Кудрявцева А.Д. Сравнительная характеристика антигенных и аллергенных свойств препаратов,выделенных из спор и мицелия некоторых патогенных грибов // сб. Вопросы микол. - Вып. ,- Горький, - 1976, - с.48-51). Для постановки реакции преципитации белковые антигены дерматомицетов получают по Белозерскому, экстракцией 0,015 М , 0,05 Ми по В.Ф. Руновой - экстракцией 1 КОН(Аспанидзе А.Н. Апробация методов извлечения антигенных комплексов из различных трихофитонов для изучения антигенных связей в РДП. // Бюлл. ВИЭВ. - Москва. - 1984. - Вып. 54. - с.44-45). Наиболее близким техническим решением по совокупности признаков и достигаемому положительному эффекту (прототипом) является получение белковых компоненты клеточной стенки гриба Т.для постановки непрямого варианта ТИФА, которые выделяют из 15-суточной культуры экстракцией охлажденным 0,67 М фосфатным буфером с рН 7,0, отделением неразрушенных клеток и центрифугированием супернатанта в режиме 25000 оборотов по методу,А. в модификации (Кухар Е.В. Выделение и характеристика белковых компонентов клеточной стенки гриба//Вестник науки Акмолинского агроуниверситета им. С.Сейфуллина. т. .7-8. Астана. 2000 г. с.172-177). Однако известный способ получения антигена имеет недостатки, т.к. антиген получают из вакцинного штамма гриба,который, как известно, является ослабленным штаммом, имеет низкий выход антигена - 1 г с 1 мл(или до 0,019 с 1 г сырой массы мицелия), требует наличия дорогостоящего оборудования. Технической задачей изобретения является разработка способа получения активного и специфичного очищенного белкового антигена в достаточном количестве с высокой концентрацией белка и с минимальными затратами с целью использования в серологической диагностике трихофитии сельскохозяйственных животных,которая достигается тем, что при получении антигена двухнедельную культуру дерматомицета отделяют от жидкой питательной среды фильтрованием через бумажный фильтр, отмывают от культуральной жидкости и подвергают фенольноводной экстракции в течение суток с целью максимального освобождения от полисахаридов. Обработанную биомассу ресуспендируют цитратным буфером из расчета 2 мл на 1 г клеток и инкубируют в течение 16-20 часов при температуре 37 С при постоянном перемешивании, после чего центрифугируют в течение 20 минут при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость (супернатант) сливают и центрифугируют повторно 20 мин при 3000 об/мин. Полученный антиген характеризуется высоким содержанием белка,наличием преципитирующих свойств при постановке реакции преципитации и достаточно высокой активностью в иммуноферментном анализе. Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Глубинное культивирование дерматомицетов рода . Референтные штаммы дерматомицетов реклонируют на агаре Сабуро (глюкоза - 4 г, пептон - 1 г, агар Дифко 2 г,- 0,5 г, дистиллированная вода до 1 литра) с добавлением антибиотиков (соответственно,пенициллина натриевую или калиевую соль - 100 ЕД, стрептомицина сульфат - 100 мкг на 1 мл) и витамина В 1 (6 раствор тиамина-НС 1 - по 100 мкл на 100 мл питательной среды) при температуре 28 С. После формирования характерных колоний проводят пересевы в стеклянные плоскодонные колбы на 500 см 3 в жидкую среду Сабуро с антибиотиками и витамином В 1, куда инокулируют по 0,1 см 3 посевного материала (6-10 млн. клеток/мл). Глубинное культивирование проводят при температуре 28 С. Культуру выращивают в течение 15 суток на универсальных качалках с амплитудой колебания 100-120 имп./мин. При глубинном культивировании отмечают появление легкой опалесценции на 2-е сутки после посева. К 3-5 суткам формируются отдельные круглые колонии - глобулы диаметром 1-2 мм, к 15 м суткам их диаметр достигает от 0,70,38 до 0,90,27 мм. Среда в течение всего периода культивирования остается прозрачной характерного желтого цвета. 24309 Пример 2. Получение сырого мицелия дерматомицетов. Пятнадцатисуточную культуру используют для получения сырой мицелиальной массы с целью получения антигена. Грибную массу дерматофитов отделяют от жидкой питательной среды фильтрованием через бумажный фильтр. Сырой мицелий трижды промывают физиологическим раствором, взвешивают после отстаивания в течение одного часа для максимального освобождения от жидкости. Выход биомассы дерматомицетов родапри глубинном культивировании составляет от 2,640,49 до 5,210,43 г на 100 мл питательной среды. Пример 3. Выделение белкового антигена клеточной стенки грибов-дерматомицетов. Отмытую грибную массу тщательно суспендируют в 45 водно-фенольном растворе при 65-68 С 1 час и при минус 18 С в течение суток с целью максимального освобождения от поверхностных полисахаридов. Охлажденную смесь центрифугируют при 3500 об/мин в течение 15 минут, супернатант сливают. Мицелиальную массу ресуспендируют буфером для экстракции (0,1 М цитрат натрия, 1,0 М , 0,1 тритон Х-100, рН 6,0) из расчета 2 мл на 1 г клеток и инкубируют в течение 16-20 часов при температуре 37 С при постоянном перемешивании,после чего центрифугируют в течение 20 минут при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость (супернатант) сливают и центрифугируют повторно 20 мин при 3000 об/мин. Раствор антигена хранят при температуре 4 С. Выход антигена составляет 1,5 мл с 1 г сырого мицелия гриба. Пример 4. Стандартизация антигена по содержанию белка. Концентрация белков определяется по методу Бредфорда. В лунки первого ряда вносят по 0,1 мл пробы белка неизвестной концентрации и бычий сывороточный альбумин (БСА) в концентрации 1 мг/мл в качестве контроля. В лунки следующих рядов вносится по 0,05 мл фосфатно-буферного раствора. Опытные и контрольные пробы белка титруют в объме 0,05 мл. В каждую лунку вносится по 0,05 мл реактива Бредфорда, результат учитывается на спектрофотометре при длине волны 492 нм или визуально. Концентрация белков в растворе антигена находится в среднем 0,2500,22 мг/мл. В полученных антигенах соотношение белков к углеводам по концентрации составляет 81. Концентрация углеводов в растворе антигена определяется сернокислотным методом и составляет 0,030,25 мг/мл. Таким образом, выход антигена по белку составляет 0,038 с 1 г сырого мицелия грибов. Рабочая концентрация антигена для использования в иммуноферментном анализе составляет 0,01 мг/мл по белку. Пример 5. Изучение антигенных свойств. Антигенные свойства предложенного белкового антигена для серологической диагностики трихофитии животных оценивают в сравнении с полисахаридным антигеном,полученным известным способом по Вестфаль-Яну с использованием водно-фенольной экстракции, в различных серологических реакциях реакции агглютинации в микроварианте (РМА), реакции иммунодиффузии (РИД) и в непрямом варианте твердофазного иммуноферментного анализа(ТИФА). Результаты изучения антигенных свойств предложенного антигена показывают наличие антигенной активности и высоких титров антител в ТИФА - до 125600, наличие преципитирующих свойств при постановке РИД, в которой регистрировали одну линию преципитации,отсутствие агглютинирующих свойств. Следует отметить, что белковый комплекс,выделенный из гриба Т. , обладает выраженными антигенными свойствами,не уступающими полисахаридному антигену. Максимальный титр антител, выявляемый белковым антигеном составляет 125600, что аналогично данным полисахаридного антигена, но в некоторых пробах значения титров антител ниже на один порядок, чем при работе с полисахаридным антигеном. Таким образом,у белкового антигена установлено наличие преципитирующих свойств,выражена высокая активность в ИФА. Пример 6. Выявление антигенной активности. Антигенную активность белкового антигена изучали в непрямом варианте твердофазного иммуноферментного анализа(ТИФА) с сыворотками крови телят, иммунизированных вакциной ЛТФ-130. При тестировании сывороток крови телят с помощью белкового антигена,выявлено наличие титров противотрихофитийных антител до 112800. При этом показатели оптической плотности(ОП) при спектрометрическом учете результатов реакции имеют высокие значения в разведении 1200,которое является диагностическим титром, что говорит о высокой активности антигена и делает возможным его использование в ТИФА (таблица 1). Таблица 1 Результаты изучения антигенной активности белкового антигена гриба Т. , полученного по методу .. (1979) в ТИФА Показатели ОП при длине волны 492 нм Сыворотка 1 Сыворотка 2 1,724 24309 Пример 7. Выявление специфичности антигена. Специфичность предложенного антигена для серологической диагностики трихофитии крупного рогатого скота оценивают в сравнении с аналогичными антигенами из грибов рода Т.и Т.и неродственного гриба. В качестве антител использовали сыворотки крови белых мышей, иммунизированных белковым комплексом Т.(таблица 2). Таблица 2 Результаты изучения специфичности белковых антигенов различных грибов в ИФА 3, при Р 0,05 Белковые антигены, полученные по методу Титры антител сывороток крови белых мышей,.. (1979) иммунизированных белковым антигеном Т.Т.116000,33 Т.18000,22 Т.14000,331500,0 Как видно из таблицы, установлено наличие слабоположительной перекрестной реакции между белковыми антигенами всех грибов родаи отсутствие перекрестной реакции с антигеном гриба рода(титр в значении 150 является фоновым показателем). Показатели титров антител, выявляемые антигеном гриба Т., выше титров антител в сыворотках крови белых мышей, выявляемых антигенами других трихофитонов. Все антигены грибов родавыявляют противотрихофитийные титры антител в сыворотках крови животных, что подтверждает информацию других авторов о наличии перекрестной реакции между антигенами дерматофитов, полученных из близкородственных штаммов,однако титры антител против собственного антигена выше на 1-2 порядка, что говорит о достаточной специфичности полученного антигена. Таким образом, предложенный способ позволяет получить антиген для серологической диагностики трихофитии крупного рогатого скота, который является достаточно чувствительным. Выявлена высокая антигенная активность и достаточная специфичность белкового препарата гриба Т.- возбудителя трихофитии крупного рогатого скота. Использование предлагаемого способа позволит получить активный и специфичный антиген для применения в иммуноферментном анализе и реакции преципитации при серологической диагностике трихофитии животных, имеющий простую технологию производства, высокий выход антигена с 1 г биомассы и легкость в стандартизации по содержанию белка. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения антигена из дерматомицетов для серологической диагностики, включающий глубинное культивирование дерматомицетов,отмывание сырой мицелиальной массы гриба от культуральной жидкости, которую ресуспендируют нитратным буфером в течение 16-20 часов при температуре 37 С при постоянном перемешивании,центрифугируют в течение 20 минут при 3000 об/мин и повторно центрифугируют супернатант в том же режиме, отличающийся тем, что при получении антигена используется сырая мицелиальная масса двухнедельной культуры гриба,которая отмывается от культуральной жидкости и подвергается водно-фенольной экстракции при 6568 С 1 час и при минус 18 С в течение суток с целью максимального освобождения от полисахаридов, после чего белки экстрагируются цитратным буфером в течение 16-20 часов при температуре 37 С при постоянном перемешивании,и отделяются от биомассы центрифугированием в течение 20 минут при 3000 об/мин.