Способ получения сыворотки против рожи свиней

(51) 61 39/395 (2006.01) 61 39/40 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Способ получения гипериммунной сыворотки против рожи свиней включает приготовление антигена для иммунизации, гипериммунизацию продуцентов, взятие крови и отделение сыворотки,при этом в качестве антигена используют смесь культуры вакцинного штамма-2 в концентрации 10 млрд. м.т./мл и ультразвукового дезинтеграта вакцинного штаммаВР-2, приготовлений из суспензии с концентрацией 10 млрд. м.т./мл, в соотношении 51 или 101 грундиммунизацию осуществляют подкожно, двукратно в дозе 5 см 3 с интервалом 7 дней, а гипериммунизацию - через 21 день после грундиммунизации 6-кратным подкожным введением антигена с интервалом 5 дней в дозе 5-20 см 3. Способ позволяет повысить безопасность процесса, активность целевого продукта, сократить длительность процесса и упростить его.(72) Иванов Николай Петрович Хусаинов Дамир Микдатович(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТКИ ПРОТИВ РОЖИ СВИНЕЙ(57) Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии и может быть использовано для получения сыворотки, используемой при лечении и профилактике рожи свиней. 17529 Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии и может быть использовано для получения сыворотки, используемой при лечении и профилактике рожи свиней. Известен способ изготовления сыворотки против рожи свиней, включающий приготовление антигена для иммунизации, гипериммунизацию продуцентов,взятие крови и отделение сыворотки. При этом в качестве продуцентов используют свиней(Инструкция по изготовлению и контролю сыворотки против рожи свиней. Утверждена Главным управлением ветеринарии Госагропрома СССР 23 июля 1987). Однако данный способ экономически высокозатратный, так как срок эксплуатации свиней составляет всего 5-6 месяцев. Известен также принятый за прототип способ изготовления сыворотки против рожи свиней,включающий приготовление антигена для иммунизации, гипериммунизацию продуцентов,взятие крови и отделение сыворотки. При этом в качестве продуцентов используют волов, а в качестве антигена используют инактивированный вирулентный штамм и концентрированный живой антиген (Патент России 2169582, А 61 К 39/395,39/40, 2001). Данный способ является небезопасным и трудоемким, а большое количество вводимого антигена и значительное число инъекций оказывает дополнительную нагрузку на иммунную систему продуцентов и не приводит к повышению активности сыворотки. Задачей изобретения является разработка способа получения сыворотки против рожи свиней,обеспечивающего снижение безопасности процесса,повышение активности целевого продукта,сокращение длительности и упрощение способа. Способ получения гипериммунной сыворотки против рожи свиней включает приготовление антигена для иммунизации, гипериммунизацию продуцентов, взятие крови и отделение сыворотки,при этом в качестве антигена используют смесь культуры вакцинного штамма-2 в концентрации 10 млрд. м.т./мл и ультразвукового дезинтеграта вакцинного штаммаВР-2, приготовлений из суспензии с концентрацией 10 млрд. м.т./мл, в соотношении 51 или 101 грундиммунизацию осуществляют подкожно, двукратно в дозе 5 см 3 с интервалом 7 дней, а гипериммунизацию - через 21 день после грундиммунизации 6-кратным подкожным введением антигена с интервалом 5 дней в дозе 5-20 см 3. Способ осуществляется следующим образом. Рожистый антиген готовят из вакцинного штамма-2, который культивируют в течение 20-22 ч на жидкой питательной среде. По окончании культивирования часть полученной бактериальной массы подвергают дезинтеграции ультразвуком при 22-35 кГц и мощности 70-90 Вт/см 2, генерируемых УЗДН-1 или УЗДН-2 в течение 30-40 минут (до слабого просветления). По истечении указанного времени 2 ультразвуковой лизат смешивают 15 - 110 с 10 млрд-ной взвесью бактериальной массы. Грундиммунизацию проводят двукратно подкожно в разные стороны средней трети шеи приготовленным антигеном с интервалом 5-7 дней, а гипериммунизацию осуществляют через 21 день после грундиммунизации 6-кратными подкожными инъекциями смеси ультразвукового лизата и корпускулярного живого антигена из вакцинного штамма с интервалом 5 дней в дозах при(лизат),при грундиммунизации 5 см 3 гипериммунизации 5, 10,10, 15, 15,20 см 3. В процессе эксплуатации после каждого взятия крови через 7 дней проводят очередную подкожную инъекцию антигена в дозе 10 см 3, а через 15-20 суток после последней инъекции антигена и при наличии достаточного титра антител осуществляют следующее крововзятие. 1. Получение антигена для иммунизации Готовят расплодку обычным методом, то есть сухую культуру штамма ВР-2 засевают в 0,050,1 дм 3 флаконы с мясопептонным бульоном (МПБ) и культивируют в течение 24 ч при температуре 3637 С. Затем эту культуру вносят в 10-литровые бутыли с питательной средой. Культивирование осуществляют в течение 2022 ч при температуре 35,50,5 С, рН 6,9-7,2. По окончании культивирования часть бактериальной массы подвергают ультразвуковой дезинтеграции. 2. Дезинтеграция В полученную, как описано выше, суспензию(концентрация 10 млрд. микробных клеток в 1,0 см 3) добавляют 0,05 М триса или 1/15 М двузамещенного фосфорнокислого натрия (рН 9,0-9,2) и подвергают воздействию ультразвуковых волн с частотой колебательных движений 22-35 кГц и мощности 7090 Вт/см 2, генерируемых УЗДН-1 или УЗДН-2 в течение 30-40 минут (до слабого просветления). По истечении указанного времени ультразвуковой лизат смешивают 15-110 с 10 млрд-ной взвесью бактериальной массы. 3. Грундиммунизация В качестве продуцентов используют здоровых,некастрированных 2-3 годовалых бычков. Грундиммунизацию проводят двукратно, подкожно,в разные стороны средней трети шеи с интервалом 7 дней, смеси дезинтеграта с 10 млрд-ной взвесью бактериальной массы рожистых бактерий в количестве 5 см 3. 4. Иммунизация Иммунизацию бычков осуществляют через 21 день после последнего введения антигена грундиммунизации,6-кратными подкожными инъекциями антигена (смеси ультразвукового лизата и корпускулярного живого антигена из вакцинного штамма) с интервалом 5 дней в количестве при грундиммунизации 5 см 3, при гипериммунизации 5,10, 10, 15, 15, 20 см 3. 5. Крововзятие Производственное крововзятие осуществляют при достижении активности не менее ЕД 500,005(5,0). Взятие крови осуществляется по 17529 исключающей контакт с внешним инфицированным воздухом закрытой системе, включающей иглу для взятия крови, отходящий от нее силиконовый шланг, соединенный с флаконом для отбора крови, в котором содержится 30-50 см 3 1 хлорида натрия,из расчета на 1 дм 3 крови. Кровь берут от животных-продуцентов из яремной вены в области средней трети шеи,предварительно обработав место взятия дезинфицирующим раствором. Флакон заполняют на 70-80 , после чего силиконовые шланги зажимают кровоостанавливающими пинцетами, а воздушку - зажимами. Флаконы с кровью помещают в термостат при температуре 37-38 С на 1,5-2 часа для образования сгустка. Затем их переносят в холодильную камеру с температурой 4-8 С на 6-8 часов для отделения сыворотки. В процессе эксплуатации после каждого взятия крови через 7 дней проводят очередную внутримышечную инъекцию антигена в дозе 200 млрд. м.т., а через 10-14 дней после этого от продуцентов снова берут кровь. 6. Сбор сыворотки Флаконы, заполненные кровью, подвергают обработке дезинфицирующими средствами (3 р-р перегидроля, 70 р-р этилового спирта) и транспортируют в боксовое помещение. В боксе над пламенем горелки пробки с вмонтированными в них трубками и шлангами удаляют, а горлышки флаконов, размещенных под углом 45 к горелке, обрабатывают спиртом. Отсасывание производят с помощью изогнутой на конце под углом 30-35 стеклянной трубки диаметром 10 мм, длиной 150 мм, которая герметично соединяется при помощи силиконового шланга с сосудом для сбора сыворотки,находящимся под отрицательным давлением 0,2 атм. Сыворотку для выпуска в реализацию консервируют 0,5 фенолом, разливают в стерильные флаконы, закрывают стерильными пробками и обкатывают металлическими колпачками. 7. Контроль сыворотки Для контроля препарата на стерильность производятся посевы на питательные среды 2 пробирки МПБ, 2 пробирки МППБ под вазелиновым маслом, 2 пробирки скошенного МПА,2 пробирки среду Сабуро и выдерживаются в термостате при температуре 37 С в течение 10 суток (среда Сабуро выдерживается в термостате при температуре 26-28 С в течение 10 суток). Отсутствие роста микрофлоры подтверждает стерильность препарата. На безвредность проверяют путем подкожного введения препаратов в дозах по 0,5 см 3 шести белым мышам весом 18-22 г, и по 2 мл двум морским свинкам весом 350-450 г. Наблюдение за животными ведется в течение 10 суток. Для проверки на активность 15 белым мышам массой 17-20 г вводят в брюшную полость сыворотку в дозах 0,01 0,02 и 0,03 см 3 (по пять мышей на дозу). Разведения сыворотки делают на физиологическом растворе. Через 1/2-2 ч всем привитым сывороткой 15 белым мышам и пяти непривитым вводят подкожно в объеме 0,1-0,2 см 3 суточную культуру вирулентного штамма возбудителя рожи свиней в разведении 1200. Сыворотку считают активной, если все 15 белых мышей, привитых сывороткой, остаются живыми в течение 10-дневного наблюдения,а пять контрольных погибают в течение 3-4 суток. Допускается гибель двух белых мышей в дозе 0,02 см 3. 8. Применение сыворотки Сыворотку против рожи свиней применяют с профилактической и лечебной целью. Она пригодна для применения в течение двух лет со дня изготовления при условии хранения в темном сухом помещении при температуре 2-15 С. Дозы сыворотки с профилактической целью поросятам-сосунам вводят 5 см 3, подсвинкам массой до 50 кг - 10 см 3, свиньям массой выше 50 кг 20 см 3. Пассивный иммунитет у привитых животных сохраняется до 14 дней. С лечебной целью сыворотку применяют поросятам-сосунам в дозе 10 см 3, подсвинкам массой до 50 кг -50 см 3 свиньям массой выше 50 кг - 75 см 3. Предложенный способ апробирован с положительными результатами в лабораторных и производственных условиях на поголовье 76 голов свиней различного возраста с лечебной и профилактической целью. Предложенный способ в отличие от известного обладает следующими преимуществами 1) использование дезинтегрированного антигена позволяет во-первых,повысить выход специфического антигена, что в свою очередь способствует повышению активности сыворотки во-вторых, снизить неспецифическую нагрузку на иммунную систему продуцентов и реактогенность антигена 2) использование в качестве антигена живого корпускулярного антигена в виде вакцинного штамма обеспечивает безопасность антигена и возможность его введения в незначительном количестве 3) способ более прост в исполнении и менее трудоемок- сокращено количество инъекций с 25-30 до 8 сокращена длительность цикла гипериммунизации на 60 дней- исключены внутривенные инъекции антигена,которые нередко являются причиной аллергических реакций у продуцентов 4) сыворотка, полученная данным способом,более активна (на 15-20 ), обладает высокими защитными (до 95-97 вместо 84 у прототипа) и профилактическими (100 вместо 93 у прототипа) свойствами. 17529 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения гипериммунной сыворотки против рожи свиней, включающий приготовление антигена для иммунизации, гипериммунизацию продуцентов, взятие крови и отделение сыворотки,отличающийся тем, что в качестве антигена используют смесь культуры вакцинного штаммаВР-2 в концентрации 10 млрд.м.т./мл и ультразвукового дезинтеграта вакцинного штаммаВР-2,приготовленного из суспензии с концентрацией 10 млрд.м.т./мл, в соотношении 51 или 101, грундиммунизацию осуществляют подкожно, двукратно в дозе 5 см 3 с интервалом 7 дней, а гипериммунизацию - через 21 день после грундиммунизации 6-кратным подкожным введением антигена с интервалом 5 дней в дозе 5-20 см 3.