Способ получения антирабической вакцины

(51) 61 39/205 (2006.01) 12 7/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ промышленном производстве высокоиммуногенных безвредных антирабических вакцин против бешенства животных. Предложенный способ получения антирабической вакцины включает приготовление посевного материала из штамма вируса бешенства фикс, инфицирование посевным материалом перевиваемой культуры клеток фибробластов,культивирование вируса бешенства осуществляют на перевиваемой культуре клеток фибробластов, с последующей их обработкой ультразвуком и сбором вируссодержащей жидкости, инактивацию вируса с последующим приготовлением целевого продукта в жидкой или лиофилизированной форме. Способ позволяет получить вакцину,обладающую высокой иммуногенной активностью и надежно защищают животных от бешенства.(72) Иванов Николай Петрович Хусаинов Дамир Микдатович Шушаев Бахтыгери Хайруллович(56) Предварительный патент РК 13392, кл. А 61 К 39/205, 12 1/00 // (12 1/00, 12 93),2003 г. Патент РФ 2244557, кл. А 61 К 39/205, А 61 Р 31/12, 2004 г. Патент РФ 2225223, кл. А 12 К 39/29, 12 7/00, 2004 г.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ(57) Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии и может быть использовано при 17526 Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии и может быть использовано при промышленном производстве высокоиммуногенных безвредных антирабических вакцин против бешенства животных. Известен способ получения антирабической вакцины, включающий репродукцию вируса-фикс бешенства штамм овечий ВГНКИ, инактивацию вируссодержащего материала,обработку адъювантом и фасовку, согласно изобретению,культивирование вируса проводят в мозговой ткани овец, с последующим съемом ткани, дезинтеграции фиксированного вируса бешенства в 4-5 мозговой суспензии в присутствии 0,07-0,15 сапонина при температуре 27-30 С в течение 20-36 часов,стабилизацию фиксированного вируса в присутствии 0,03-0,05 раствора формалина в течение 20-36 часов при температуре 27-30 С,смешивание полученной суспензии с адъювантом стерильным коллоидным раствором гидрата окиси алюминия на цитратно-фосфатном буфере с рН 7,07,4 в концентрации 24-25 (предварительный патент РК 13392, А 61 К 39/205, С 12 1/00, (С 12 1/00,С 12 193, 2003). Однако в известном способе культивирование вируса проводят в мозговой ткани при жизни животного,что приводит к значительной себестоимости, потере животных в процессе изготовления вакцины и возможности включения в ее состав возбудителя прионных инфекций. Из-за значительной инфицированности овец возбудителем скрейпи существует постоянная угроза его попадания с мозговой тканью в состав изготовляемой вакцины, как следствие этого,распространение этой инфекции среди прививаемого поголовья сельскохозяйственных и домашних животных. Поэтому процесс получения мозгового посевного материала является очень ответственной, трудоемкой и дорогостоящей операцией, связанной с тщательным отбором животных и контролем мозговой вируссодержащей ткани и изготовленных серий вакцины на наличие посторонних агентов. Задачей изобретения является создание промышленной технологии производства антирабической вакцины из вируса вируса-фикс,путем выращивания его к культуре клеток фибробластов. Задача решается путем культивирования известного штамма ВГНКИ вируса-фикс на культуре клеток фибробластов с последующим отделением вируса от клеточного детрита с помощью обработки культуры клеток ультразвуком,сбором вируссодержащей жидкости, инактивацией вируса и добавлением гидроксала или лиофильным высушиванием. Технический результат изобретения заключается в упрощении технологии производства вакцины,сокращении затрат, повышении иммуногенности и безопасности получаемой вакцины за счет получения полноценных вирионов с полным спектром антигенов и исключения возможности попадания в ее состав возбудителя прионов. 2 Сущность изобретения. Способ получения антирабической вакцины включает приготовление посевного материала из штамма вируса вирусафикс, инфицирование посевным материалом перевиваемой культуры клеток фибробластов,культивирование вируса-фикс, с последующим отделением вируса от клеточного детрита с помощью обработки культуры клеток ультразвуком,сбор вируссодержащей жидкости, инактивацию вируса с последующим приготовлением целевого продукта в жидкой или лиофилизированной форме,и отличается тем, что вируссодержащую суспензию получают путем культивирования на перевиваемой культуре клеток фибробластов,а не интрацеребральным заражением овец, а клетки фибробластов для полного отделения вируса дополнительно обрабатывают ультразвуком. Для получения вирусного материала полностью исключаются овцы. Вакцины, приготовленные согласно изобретению, при более производительном и технологичном способе изготовления обладают большей иммуногенной потенцией и более надежно будут защищать животных от бешенства. Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример. Для приготовления вакцины используют культуру перевиваемых клеток фибробластов, которую получают роллерным способом в виде кругового монослоя в бутылях. В качестве ростовой и поддерживающей питательной среды используют среду на основе среды Иглаи 5-7 -ной нативной сыворотки крупного рогатого скота. 2-3-суточный монослой клеток инфицируют посевным материалом. Культивирование осуществляют роллерным способом при температуре 37 С. Начиная с 4-х суток культивирования, включение сыворотки крупного рогатого скота в состав питательной среды не требуется. Далее взвесь культуры клеток подвергают воздействию ультразвуковых волн (с помощью ультразвукового диспергатора УЗДН-1 при частоте 20-30 кГц, мощности 50-70 Вт/см 2 в течение 5-10 минут). Полученный сбор инактивируют известным способом, например, бетапропиолактоном. Для изготовления сухих антирабических вакцин к 2-м частям инактивированной вируссодержащей жидкости добавляют 1 часть среды высушивания. Для изготовления жидкой антирабической вакцины к инактивированной вируссодержащей жидкости добавляют адъювант - 6 -ную гидроокись алюминия. Проверенную на чистоту вакцину расфасовывают по 50, 100, 200 и 500 мл в стерильные стеклянные флаконы. Флаконы герметично закрывают стерильными резиновыми пробками, обкатывают алюминиевыми колпачками. Погрешность разлива составляет 3 . Контроль вакцины. Вакцину проверяют на чистоту, безвредность, иммуногенность и степень инактивации вируса-фикс. 17526 Чистоту вакцины проверяют согласно методическим указаниям по бактериологическому контролю стерильности ветеринарных биологических препаратов по общепринятым методикам. Посевы вакцины на питательные среды должны быть стерильны. Безвредность каждой серии вакцины проверяют на 6 белых мышах массой 16-18 г. Подкожное введение в область спины разведенной 13(физиологическим раствором) вакцины в дозе по 0,5 мл не должно вызывать клинического заболевания и гибели мышей. Срок наблюдения - 10 суток. Иммуногенность вакцины проверяют на 10 клинически здоровых 12-18-месячных овцах массой не менее 25 кг, полученных из хозяйств,благополучных по инфекционным болезням и ранее не вакцинированных против бешенства. Для этого 5 овец первой группы подвергают однократной иммунизации вакциной в дозе 4 мл подкожно в среднюю треть шеи. На 23-28 сутки после иммунизации всех овец (5 привитых и 5 контрольных) невакцинированных заражают интрацеребрально матровой расплодкой вируса в дозе 0,2 мл в разведении 11000-110000 белых мышей) - минимальной дозой вируса бешенства, вызывающей гибель от бешенства 100 неиммунных контрольных животных. За животными наблюдают 14 дней, учитывая клинику заболевания. Вакцину признают достаточно иммуногенной, если из 5 вакцинированных заболевают бешенством не более 1 овцы при заболевании 5 контрольных невакцинированных овец. Вакцина годна к применению в течение 14 месяцев при условии ее хранения при температуре 4-10 С. Вакцину применяют для профилактических и вынужденных прививок крупного и мелкого рогатого скота, лошадей, верблюдов, свиней и оленей. Животных вакцинируют однократно в дозах от 2 до 10 мл в зависимости от вида и возраста. Вакцину вводят подкожно или внутримышечно, в области средней трети шеи или крупа (свиньям внутримышечно - за ухом). Иммунитет у привитых животных наступает через 5-14 дней после прививки и сохраняется не менее 18 месяцев. Для выявления преимуществ предложенного способа в сравнении с ближайшим аналогом приводим следующую таблицу. Таблица Иммуногенная потенция вакцины Иммунитет у привитых животных развивается через 1421 день и сохраняется не менее 18 месяцев Иммунитет у привитых животных развивается черездней и сохраняется не менее 18 месяцев Известный способ Предложенный способ Для получения вирусного материала полностью исключаются овцы. Вакцины, приготовленные согласно изобретению, при более производительном и технологичном способе изготовления обладают большей иммуногенной потенцией и более надежно будут защищать животных от бешенства. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения антирабической вакцины,включающий репродукцию вируса бешенства,инактивацию вируссодержащего материала,обработку адъювантом и фасовку, отличающийся тем, что репродукцию вируса штамма фикс осуществляют на перевиваемой культуре клеток фибробластов с последующей их обработкой ультразвуком, сбором вируссодержащей жидкости,инактивацией вируса и приготовлением целевого продукта в жидкой или лиофилизированной форме.