Способ получения бактериального препарата пастообразной формы на основе азотфиксирующих бактерий

МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Техническим результатом является способ получения бактериального препарата пастообразной формы на основе азотфиксирующих бактерий,включающий выращивание посевной культуры,изготовление рабочей культуры и адсорбцию клеток бактерий на носителе, в котором адсорбцию клеток бактерий осуществляют на смеси бентонита и цеолита, взятых в массовых соотношениях 10,75 11. Способ позволяет существенно сократить процент гибели бактериальных клеток на носителе,повысить титр и жизнеспособность клеток, а также активность азотфиксирующих бактерий при хранении до 5 месяцев по сравнению с 3 месяцами в прототипе.(72) Идрисова Ульбосын Ротаевна Саданов Аманкелди Курбанович Мусалдинов Тулеген Ботпаевич Идрисова Динара Жейписовна Айткельдиева Светлана Айткельдиевна Треножникова Людмила Петровна(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Таза Су(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА ПАСТООБРАЗНОЙ ФОРМЫ НА ОСНОВЕ АЗОТФИКСИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ(57) Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности, к способам получения препаратов азотфиксирующих бактерий. Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности, к способам получения препаратов на основе азотфиксирующих бактерий. Известен способ получения биоудобрения,включающий приготовление микробной биомассы и иммобилизацию биомассы на органическом носителе, при этом в качестве органического носителя используют сухой гранулированный куриный помет (Пат.2130005, кл. 05 11/08, оп. 10.05.1999 г.). Недостаток технического решения заключается в том, что за счет высушивания и иммобилизации биомассы на сухом органическом носителе сокращается срок его хранения, кроме того,учитывая кислую реакцию носителя, требуется корректировка . Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является способ получения пастообразного препарата азотфиксирующих бактерий путем выращивания посевного материала в питательной среде с кукурузным и дрожжевым экстрактом, глубинного культивирования в ферментерах,осаждения биомассы бентонитом, декантации надосадочной жидкости,центрифугирования с получением концентрата клеток азотфиксирующих бактерий в виде пасты (Инновационный патент 23470, кл. 05 11/08, оп.15.12.2011 г.). Недостатком этого способа является короткий срок хранения готового пастообразного препарата, составляющий 3 месяца и невысокий титр бактерий- невысокая емкость катионного поглощения,избирательность по отношению к отдельным катионам питательной среды и их сорбции- отсутствие пролонгирующего эффекта, т.е. продлевающего срок действия свойства- не позволяет получать биопрепараты высокого качества с минимальными затратами на приготовление. Задачей изобретения является повышение содержания азотфиксирующих бактериальных клеток в препарате и увеличение срока хранения готового пастообразного препарата. Для этого в способе получения бактериального препарата пастообразной формы на основе азотфиксирующих бактерий,включающем выращивание посевной культуры, изготовление рабочей культуры и адсорбцию клеток бактерий на носителе, согласно изобретению адсорбцию клеток бактерий осуществляют на смеси бентонита и цеолита, взятых в массовом соотношении 0,751 - 11. Для получения бактериального препарата в качестве носителя и источника биогенных элементов используют цеолит Чанканайского месторождения(Республика Казахстан). Химический состав цеолита и его адсорбционные свойства, наличие огромной внутренней поверхности кавернозной структуры минерала,достигающей 47,обусловливает возможность его использования в качестве носителя для азотфиксирующих бактерий в составе бактериальных препаратов. Чанканайский цеолит относится к особо ценной разновидности минералов клиноптилиолит (К 2, 2, Са) 2 7,5.-11,0 О 19,0-26,0 2(6-8 Н 2 О). Клиноптилиолит - высококремнистый цеолит с соотношением кремнезема к глинозему 3,5 10,5 и содержит высокий процент двуокиси кремния(60-74). В химическом составе цеолита Чанканайского месторождения присутствуют основные элементы (в ) О 2 - 60-74 А 23 - 14-15 23 - 1,4-5,83- 0,067- 0,199- 0,02-2,12 СаО - 0,13-6,40 2 - 0,615,45 2 - 0,66-4,03 Р 25- 0,012-0,173 Т 2 - 0,07-0,7 3 - 0,99 Н 2 - 0,004,09. В качестве микропримесей цеолит содержит Со, С, , , ,и другие микроэлементы в 100-1000 долях процента. Отношение 2/А 23 4,0-5,28. Кислотоустойчивость - 80-87. Высокая емкость обменных катионов (в мг экв/г) Са 2 - 0,550,63 2 - 0,024 - 0,070 -0,035 - 0,065- 0,025- 0,072. Емкость поглощение по иону аммония (мг экв/г) - 0,75-1,25. Кроме высокой емкости катионного поглощения, избирательности по отношению к отдельным катионам почвенного раствора или питательной среды и их сорбции, цеолит позволяет сортировать на своей поверхности, оптимизировать и удерживать в закрепленном состоянии ионы макро- и микроэлементов, а затем закрепленные ионы служат источником питания для растении и микроорганизмов. Цеолит - клиноптилиолит обладает пролонгирующим, т.е. продлевающим срок действие свойствами, снижает потери элементов питания. Внесение цеолита в среду для культивирования увеличивает титр клеток азотфиксирующих бактерий по сравнению с прототипом. Полезные адсорбционные и ионообменные свойства природных цеолитов и содержание в них значительного количества минеральных солей, обеспечивают их применение в качестве элементов питания и носителей иммобилизованных клеток микроорганизмов. Заявленный способ подтверждается следующим примером. Пример Для выращивания посевной культуры азотфиксирующих бактерий соиАКС-17 готовят жидкую питательную среду следующего состава, г/л 2 НРО 4 - 1,0 4 0,3- 0,1 Глюконат кальция - 1,5 Дрожжевой экстракт -2,0 3- 0,01 сахароза -10,0 горох - 50,07,0. Питательную среду разливают в колбы Эрленмейера вместимостью 750 мл по 200 мл и стерилизуют при 121 С в течение 30 минут. Колбы засевают смывом с твердых агаровых косяков культуры клубеньковых бактерий, помещают на орбитальный шейкер и выращивают при температуре 28 С в течение 48 часов при 180-200 об/мин. Затем посевной материал переносится в ферментер емкостью 10 л, наполненный питательной средой указанного состава. Рабочую культуру выращивают при температуре 28 С в течение 24 часов при 300400 об/мин. Далее для получения пастообразного препарата азотфиксирующих бактерий в рабочую культуру добавляют 3 растворенной в питьевой воде смеси бентонита и цеолита в массовом соотношении 10,5 10,75 и 11, смесь перемешивают и оставляют в прохладном месте на 3 ч. Надосадочную жидкость,составляющую 2/3 всего объема, декантируют, а осадок центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин,получают биомассу бактерий,адсорбированную на смеси бентонита и цеолита. Титр бактерий в пасте определяют путем высева из соответствующих разведений в чашки Петри с плотной средой Мазэ следующего состава, г/л 2 НРО 4 - 0,5 О 4 - 0,3- следы сахароза 10,0 агар - 10,0. В среду добавляется отвар гороха. Для этого 50 г гороха кипятят в течении 30 минут в водопроводной воде объмом 400 мл, затем полученный жидкий отвар фильтруют и добавляют в среду с солями с доведением до 1 литра. Затем бактериальную пасту хранят в герметично упакованных пакетах при температуре 4-10 С. Титр готового продукта на протяжении хранения должен быть не менее 109 КОЕ/г. Кроме того, определяли изменение нитрогеназной (азотфиксация) активности пастообразных препаратов при хранении по восстановлению ацетилена в этилен методом газовой хроматографии на хроматографе марки Хром-3 на колонке с силикагелем АСК при температуре 50 С. Величину нитрогеназной активности выражают в нмоль С 2 Н 4/ч/ 1 млн. клеток штамма клубеньковых бактерий. Результаты исследований представлены в таблицах 1 и 2. Как видно из таблицы 1, использование для осаждения биомассы клубеньковых бактерий в смеси бентонита и цеолита взятых в соотношении 10,75 и 11 позволяет повысить количество жизнеспособных клеток клубеньковых бактерий 1,5109 и 9 3,510 КОЕ/г, соответственно, по сравнению с прототипом 7,0103 КОЕ/г и срок хранения пастообразного препарата увеличивается на 5 месяцев, что на 2 месяца больше относительно прототипа (3 месяца). При этом также сохраняется более высокая азотфиксирующая активность клубеньковых бактерий в смеси бентонита и цеолита взятых в соотношении 10,75 и 11, где уровень нитрогеназной активности за 5 месяцев хранения составила 11,9 нмоль С 24/час и 12,6 нмоль С 24/час,соответственно, по сравнению с прототипом 4,7 нмоль С 24/час (таблица 2). Таблица 1 Жизнеспособность клеток клубеньковых бактерий в разных формах пастообразного препарата через 5 месяцев хранения Формы препаратов Пастообразный препарат по прототипу Пастообразный препарат с цеолитом и бентонитом 11 Пастообразный препарат с цеолитом и бентонитом 0,751 Пастообразный препарат с цеолитом и бентонитом 0,051 Жизнеспособность клеток клубеньковых бактерий, КОЕ/г 7,0103 3,5109 1,5109 1,5107 Таблица 2 Азотфиксирующая активность клубеньковых бактерий сои через 5 месяцев хранения Формы препаратов Пастообразный препарат по прототипу Пастообразный препарат с цеолитом и бентонитом, 11 Пастообразный препарате цеолитом и бентонитом, 0,751 Пастообразный препарате цеолитом и бентонитом, 0,51 Таким образом, способ получения бактериального препарата пастообразной формы на основе азотфиксирующих бактерий не только позволяет получить высокий титр жизнеспособных клеток клубеньковых бактерий, но и продлевает срок хранения и азотфиксирующую активность бактерий в пастообразном препарате, за счет наличия в нем природного минерала - цеолита. Адсорбционные свойства цеолита и содержание в них значительного количества оптимизированных минеральных солей,обеспечивают их применение в качестве элементов питания и носителей иммобилизованных клеток микроорганизмов. Наличие в внутренней поверхности цеолита кавернозной структуры и ионообменные свойства продлевают длительность действие элементов питания. Все перечисленные полезные свойства, способствуют повышению выхода готового продукта с высоким титром бактериальных клеток и увеличивает срок хранения готового пастообразного препарата,что свидетельствует о преимуществе предлагаемого способа по сравнению с прототипом. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения бактериального препарата пастообразной формы на основе азотфиксирующих бактерий, включающий выращивание посевной культуры, изготовление рабочей культуры и адсорбцию клеток бактерий на носителе бентоните,отличающийся тем, что адсорбцию клеток бактерий осуществляют на смеси бентонита и цеолита, взятых в массовых соотношениях 10,75-11.