Способ получения пастообразного препарата азотфиксирующих бактерий под горох

(51) 12 1/20 (2006.01) 12 1/02 (2006.01) 05 11/08 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Сущность изобретения. Для культивирования азотфиксирующих бактерий используют оптимизированную питательную среду, в которой исключен из состава натрий хлористый, уменьшено содержание кукурузного экстракта в 2 раза, глюкоза заменена на сахарозу, дополнительно введены мел и гороховый отвар при следующем соотношении компонентов, г/л кукурузный экстракт - 2,5-3,5 гороховый отвар - 40-60 мл глюкоза - 8,0-11,0 К 2 НР 4 - 0,3-0,8 (4)24 - 0,3-0,8 472 - 0,1-0,3 дрожжевой экстракт 2,5-3,5 СаСО 3 - 3,0-5,0 вода питьевая - остальноесреды - 6,8-7,0. Положительный эффект. Получение пастообразного препарата предлагаемым способом позволяет увеличить содержание бактериальных клеток в культуральной жидкости,в концентрированной биомассе, повысить в 3 раза выход препарата, что в конечном итоге повышает эффективность производства.(76) Саданов Аманкелди Курбанович Гаврилова Нина Николаевна Ратникова Ирина Александровна Шорабаев Ерик Жарылкасынович(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПАСТООБРАЗНОГО ПРЕПАРАТА АЗОТФИКСИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ ПОД ГОРОХ(57) Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности - к способам получения препаратов азотфиксирующих бактерий. Задача изобретения - повышение содержания клубеньковых бактерий под горох при культивировании. Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности - к способам получения препаратов азотфиксирующих бактерий. Известен способ получения пастообразного препарата из клубеньковых бактерий(Инновационный патент РК 23491, 2010). Согласно этому способу бактерии культивируют в колбах, в ферментере на питательной среде следующего состава (г/л) кукурузный экстракт 6,0 глюкоза - 10,0- 0,2 К 2 НР 04 - 0,5(4)24 - 0,5 472 - 0,2 дрожжевой экстракт - 3,0 вода питьевая - остальноесреды 6,8-7,0. После культивирования в ферментере в течение 24-25 ч в культуральную жидкость добавляют 3 растворенного в питьевой воде бентонита, смесь хорошо перемешивают и оставляют в прохладном месте на 3 ч. За это время биомасса адсорбируется на бентоните и осаждается. Надосадочную жидкость, составляющую 2/3 всего объема, декантируют, а осадок центрифугируют при 3000 об./мин в течение 30 мин. При этом получают биомассу бактерий, адсорбированную на бентоните,в количестве 40-50 г/л с титром не менее 2,01011 КОЕ/г. В надосадочную жидкость добавляют бентонит (соотношение бентонита и жидкости 11), хорошо перемешивают и оставляют на 1,5-2 ч для набухания бентонита. В подготовленный таким образом бентонит добавляют расчетное количество биомассы азотфиксирующих бактерий для получения титра готового продукта не менее 5,0109 КОЕ/г и перемешивают на механической мешалке. Выход препарата с 1 л жидкой культуры - 2,0-2,5 кг. Недостатком этого способа является недостаточно высокий титр клубеньковых бактерий горохав жидкой культуре. Задачей изобретения является повышение содержания клубеньковых бактерий гороха при культивировании. Технический результат - увеличение содержания бактериальных клеток в культуральной жидкости, в концентрированной биомассе и повышение выхода готового препарата достигается тем, что для культивирования клубеньковых бактерий гороха используют оптимизированную питательную среду,в которой исключен из состава натрий хлористый,уменьшено содержание кукурузного экстракта в 2 раза, глюкоза заменена на сахарозу, дополнительно введены мел и гороховый отвар. Способ получения пастообразного препарата заключается в следующем. Выращивают посевной материал в колбах на качалке при 180-200 об./мин, температуре 25-28 С в течение 22-24 ч на питательной среде следующего состава, г/л кукурузный экстракт - 2,5-3,5 гороховый отвар - 40-60 мл сахароза - 8,0-11,0 К 2 НР 4 - 0,3-0,8 (4)24 - 0,3-0,8 472 - 0,1-0,3 дрожжевой экстракт - 2,53,5 СаСО 3 - 3,0-5,0 вода питьевая - остальноесреды - 6,8-7,0. Посевной материал, полученный в колбах,используют для засева вышеописанной питательной среды в инокуляторе или ферментере в количестве 2 5. Питательную среду готовят в ферментере и стерилизуют при 120 С в течение 30 минут. Температура культивирования 25-28 С Обороты мешалки 300-400 об./мин Расход технологического воздуха 1,0/мин Время культивирования 22-25 часов В культуральную жидкость, полученную после ферментации, добавляют 3 растворенного в питьевой воде бентонита,смесь хорошо перемешивают и оставляют в прохладном месте на 3 ч. За это время биомасса адсорбируется на бентоните и осаждается. Надосадочную жидкость декантируют, а осадок центрифугируют при 3000 об./мин в течение 30 мин. При этом получают биомассу бактерий, адсорбированную на бентоните. Титр бактерий определяют с помощью камеры Горяева. В надосадочную жидкость добавляют бентонит (соотношение бентонита и жидкости 11),хорошо перемешивают и оставляют на 1,5-2 ч для набухания бентонита. В подготовленный таким образом бентонит добавляют расчетное количество биомассы азотфиксирующих бактерий для получения титра готового продукта не менее 5109 КОЕ/г и хорошо перемешивают на механической мешалке. Выход пастообразного препарата с влажностью 49,5 составляет до 6-7 кг/л. Сущность изобретения подтверждается следующими примерами. Пример 1 Выращивание культуры азотфиксирующих бактерий производят на 4 вариантах питательной среды с различным соотношением компонентов, г/л(представлены в таблице 1). Посевной материал азотфиксирующих бактерийвыращивают в колбах вместимостью 750 мл, содержащих 250 мл питательной среды, на качалке при 200 об/мин в течение 24 ч при температуре 28 С. В конце ферментации культуральную жидкость микроскопируют и определяют оптическую плотность. Наработку культуральной жидкости азотфиксирующих бактерий производят в ферментере вместимостью 30 л с мешалкой. Питательную среду выше указанного состава готовят в ферментере и стерилизуют при 120 С в течение 30 минут. После охлаждения питательной среды до 28 С ее засевают пятью процентами посевного материала. Культивирование производят при следующем режиме Режим культивирования в ферментере Температура культивирования 28 С Обороты мешалки 300-400 об./мин Расход технологического воздуха 1,0/мин Время культивирования 24 часа Титр клеток в культуральной жидкости определяют путем высева из соответствующих разведений в чашки Петри на плотную питательную среду Мазэ следующего состава, г/л К 2 НР 4 - 1,0 4 - 0,3 сахароза - 10,0 горох - 100,0 вода водопроводная - до 1 л,7,0. Результаты представлены в таблице 1. Таблица 1 Титр клубеньковых бактерий гороха при росте на различных вариантах питательной среды Варианты питательной среды 1- 1 -кукурузный экстракт - 2,0 сахароза - 5,0 гороховый отвар - 30,0 К 2 НР 4 - 0,1 (4)24 - 0,1 472 - 0,05 дрожжевой экстракт - 2,0 СаСО 3 - 2,0 вода питьевая - остальное,среды - 6,8- 6,9. 2- кукурузный экстракт - 2,5 сахароза- 8,0 гороховый отвар - 40,0 К 2 НР 4- 0,3 (4)24 - 0,3 472 - 0,1 дрожжевой экстракт - 2,5 СаСО 3 3,0 вода питьевая - остальное,среды - 6,8-6,9. 3- кукурузный экстракт - 3,0 сахароза - 10,0 гороховый отвар - 50,0 К 2 НР 4 - 0,5 (4)24 - 0,5 472- 0,2 дрожжевой экстракт - 3,0 СаСО 3 - 4,0 вода питьевая - остальное,среды - 6,8-6,9. 4- кукурузный экстракт - 3,5 сахароза - 11,0 гороховый отвар - 60,0 К 2 НР 4 - 0,8 (4)24 - 0,8 472- 0,3 дрожжевой экстракт - 3,5 СаСО 3 - 5,0 вода питьевая - остальное,среды - 6,8-6,9. Противопоставляемая среда Как видно из представленной таблицы, титр клубеньковых бактерий на противопоставляемой среде равен 120,5109 КОЕ/мл. Титр бактерий при выращивании их на предлагаемой питательной среде с минимальным содержанием компонентов составляет 280,6109, а в пределах заявляемых соотношений компонентов - 400,6109- 510,7109 КОЕ/мл, что в 3-4 раза превышает уровень контроля. Пример 2. Выращивание культуры азотфиксирующих бактерий производят на питательной среде следующего состава, г/л кукурузный экстракт - 3,0 сахароза - 10,0 гороховый отвар - 50,0 К 2 НР 4 0,5 (4)24 - 0,5 472 О - 0,2 дрожжевой экстракт - 3,0 СаСО 3 - 4,0 вода питьевая- остальное,среды - 6,8-6,9. Далее наработку культуральной жидкости проводят как в примере 1. В готовую культуральную жидкость добавляют 3 растворенного в питьевой воде бентонита, смесь хорошо перемешивают и оставляют в прохладном месте на 3 ч. Затем надосадочную жидкость декантируют, а осадок центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин. При этом получают биомассу бактерий, адсорбированную на бентоните,в количестве 45-55 г/л. Титр биомассы определяют с использованием камеры Горяева. В надосадочную жидкость добавляют бентонит (соотношение бентонита и жидкости 11) и оставляют на 2 ч для набухания бентонита, который используют для стандартизации биомассы до расчетного титра бактерий 5109 КОЕ/г. Титр бактерий в стандартизованном препарате устанавливают так же, как и в жидком препарате. Результаты технологического процесса представлены в таблице 2. Таблица 2 Выходы на стадиях технологического процесса Варианты Прототип Предлагаемый способ Титр жидкой Титр концентрирован культуры, КОЕ/мл ной биомассы, КОЕ/г 120,5109 500,4109 Как видно из представленной таблицы,использование предлагаемого способа позволяет повысить содержание клеток азотфиксирующих бактерий в культуральной жидкости,концентрированной биомассе и увеличить выход готовой продукции в 3 раза. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения пастообразного препарата азотфиксирующих бактерий под горох путем выращивания посевного материала в колбах на качалке, ферментерах в питательной среде,содержащей кукурузный экстракт, дрожжевой экстракт, глюкозу, минеральные компоненты,осаждения биомассы перед центрифугированием бентонитом с получением концентрата клеток азотфиксирующих бактерий в виде пасты,стандартизованной бентонитом, отличающийся тем, что для культивирования бактерий используют оптимизированную питательную среду при следующем соотношении компонентов,г/л 3 дрожжевой экстракт - 2,5-3,5 СаСО 3 - 3,0-5,0 вода питьевая - остальное рН среды - 6,8-7,0.