Лептоспирозный, антигенный, эритроцитарный (сухой) диагностикум для экспресс-диагностики лептоспироза животных

(51) 61 39/116 (2006.01) 12 1/20 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ эритроцитарного антигенного диагностикума из местных Казахстанских штаммов(, , ) лептоспир для выявления больных лептоспирозом домашних,сельскохозяйственных, диких животных и зверей,отличающего тем, что технический результат достигается конструированием и применением лептоспирозного антигенного сухого диагностикума. Изобретение на практике позволяет ускорить,упростить и удешевить процесс предварительного отбора положительных на лептоспироз сывороток, с последующей расшифровкой с помощью реакции микроагглютинации и лизиса (Л), что является основанием для внедрения новой тактики иммунологических исследований на лептоспироз. Предлагаемый отечественный диагностикум в реакции неполной гемагглютинации (РНГА) выявляет больных лептоспирозом животных в течение 2-х часов, вместо 7-10 суток ныне существующими методами в Л.(76) Ильясов Бисенгали Керешович Тугамбаев Тлеули Идрисович Ильясов Асхат Бисенгалиевич(56) Ильясов Б.К. Эпизоотология лептоспироза животных в Казахстане и меры борьбы с ним. Алматы, 1999, с.36(СУХОЙ) ДИАГНОСТИКУМ ДЛЯ ЭКСПРЕССДИАГНОСТИКИ ЛЕПТОСПИРОЗА ЖИВОТНЫХ(57) Изобретение относится к области ветеринарии,а именно к ветеринарной эпизоотологии,иммунологии с целью применения для экспрессдиагностики лептоспироза животных. Задача изобретения разработка и конструирование иммунореагента из Казахстанских штаммов лептоспир для диагностики лептоспироза у различных животных и дальнейшее его применение в ветеринарной практике. Изобретение решает задачу конструирования отечественного высокочувствительного Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к ветеринарной эпизоотологии,иммунологии с целью применения для экспрессдиагностики лептоспироза животных. Известен способ приготовления диагностикума направленного действия (см. Ильясов Б.К. Эпизоотология лептоспироза животных в Казахстане и меры борьбы с ним, авто-реф. дисс. доктор вет. наук, 16.00.03 - Алматы, 1999 г., с 36). Сущность этой работы заключается в нижеследующем отмытые эритроциты барана дополнительно обрабатывают раствором твина 125000, в течение 15 мин. Затем осаждают и отмывают 0,9-ным раствором натрия хлорида(6,40,1) при 3000 об/мин в течение 10 минут. Танизацию проводят при (451)С в течение 30 минут. Сенсибилизацию танизированных эритроцитов антигеном к 10-ной взвеси танизированных эритроцитов при перемешивании добавляют равный объем раствора антигена и ставят на сенсибилизацию при температуре (1001)С на 1 час в водяную баню. Самое главное неосвоено его промышленное производство. Недостатком вышеуказанного прототипа является нижеследующие вышеуказанные авторы для изготовления диагностикума использовали антигены из музейных штаммов, неполностью отработанные режимы танизации, сенсибилизации. В конечном итоге указанные недостатки снижают чувствительность эритроцитарного диагностикума в реакции неполной гемагглютигации (РНГА). Тем самым, уменьшается диагностирования больных лептоспирозом животных. Задача изобретения разработка и конструирование иммунореагента из Казахстанских штаммов лептоспир для диагностики лептоспироза у различных животных и дальнейшее его применение в ветеринарной практике. Изобретение решает задачу конструирования отечественного высокочувствительного эритроцитарного антигенного диагностикума из местных Казахстанских штаммов(, , ) лептоспир для выявления больных лептоспирозом домашних,сельскохозяйственных, диких животных и зверей,отличающего тем, что технический результат достигается конструированием и применением лептоспирозного антигенного сухого диагностикума. Биологическая схема изготовления лептоспирозного антигенного эритроцитарного сухого диагностикума Кровь барана 0,9-ный Центрифугарние раствор 2000 об/мин хлорида натрия (10-1)мин Бактериальная масса культуры лептоспир Ацетон (10-15) С Убитая ацетоном бактериальная масса лептоспирозного микроба Формалин 3 Формалиннизированные Полисахаридный эритроциты антиген лептоспирозного микроба Танин (37-1)С Танизированные эритроциты Диагностикум жидкий Лиофилизация Диагностикум сухой Технологические параметры изготовления диагностикума осуществляется как ниже описано В приготовлении антигенов для производственных серий диагностикума используют местных штаммов лептоспир,входящих в стандартный диагностический набор для проведения РНГА(, , ). Для каждой серии формалинизированных эритроцитов подтитровывают оптимальную дозу с конкретной серией антигена. Затем готовят ряд разведений антигена из расчета 40, 80, 160 мкг на 1 мл 0,5-ной взвеси эритроцитов. Предварительно формализированные и танизированные 0,5-ные эритроциты разливают по пробиркам в объеме 4 мл. После добавления к танизированным эритроцитам различных концентраций антигена в объеме 4 мл смесь помещают в холодильник при температуре(4-3)С на 18-20 ч. По окончании сенсибилизации сенситин закрепляется 1 раствором формалина и выдерживают еще в течение 2 ч. При температуре(4-3)С или 30 мин при температуре (4-1)С. После закрепления эритроциты отмывают на центрифуге раствором твина - 80 в разведении 150000 при 2000 об/мин в течение 5 мин четырехкратно. Для получения лептоспирозной агглютинирующей сыворотки использовали новую схему иммунизации с применением с целью увеличения титра антител препарата полиоксидония. Убитую микробную взвесь необходимой концентрации вводят кроликам шприцем вместимостью 2 мл в краевую вену уха,полиоксидоний вводят внутримышечно 0,5 мл(концентрация полиоксидония 500 мкг/мл). Иммунизацию проводят с интервалом 3 дня. После 4 введения у кроликов берут кровь из краевой вены для определения титра антител. Тотально обескровливание кроликов производят через 7 суток после последней иммунизации. Полученные эритроциты, сенсибилизированные различными концентрациями антигена, проверяют в РНГА с лептоспирозной агглютинирующей сывороткой. Разведение антигена,которое обеспечивает выявление в РНГА антител к лептоспирозному микробу разведении 12000,принимают за оптимальную дозу. В конечном цикле получают препарат,представляющий собой формалинизированные и танизированные эритроциты барана,сенсибилизированные антигеном лептоспир. Выпускают диагностикум в жидком и сухом виде во флаконах по 2,0 мл 5-ной взвеси эритроцитов. Препарат представляет аморфную массу в виде таблетки коричневого цвета, регидрируется в 19 мл 0,85-ного раствора хлорида натрия в течение 1 мин. Диагностикум выпускается в виде набора,содержащего следующие ингредиенты- диагностикум эритроцитарный лептоспирозный антигенный сухой - 2 флакона по 2 мл 5 концентрации- эритроциты барана формализированные 50 ные для адсорбции гетерофильных антител к эритроцитам барана - 1 флакон по 10 мл- сыворотка агглютинирующая лептоспирозная жидкая 110 - 1 флакон по 1 мл- раствор твина-80 в разведении 11000 - 1 флакон по 5 мл. Способ применения Приготовление ингредиентов и исследуемого материала для постановки реакции неполной гемагглютинации(РНГА). Техника постановки РНГА 1. Диагностикум используют в 2,5-ной концентраций для постановки серологических реакций микрометодом и 0,6-ной концентрации диагностикум 2,5-ной концентрации разводят в 4 раза 0,9-ным раствором натрия хлорида- 7,2. Перед постановкой реакций диагностикум тщательно встряхивают до образования равномерной взвеси. При наличии не разбившихся комков диагностикум для постановки непригоден. 2. Сыворотка диагностическая лептоспирозная агглютинирующая кроличья проверяется в РНГА. Первая лунка принимается за разведение 120. Диагностикум считается годным при агглютинации диагностикума с прилагаемой сывороткой не ниже 1160. 3. Стабилизатор реакции - твин-80 в разведении 11000 дополнительно разводят в 100 раз 0,9-ным роствором натрия хлорида 7,2, получая разведение 1100000. 4. Подготовка сывороток для исследования. Исследуемые сыворотки разводят 0,9-ным раствором натрия хлорида- 7,2 в 10 раз и инактивируют прогреванием на водяной бане при температуре (56-1)С в течение 30 мин, добавляют 0,1 мл консерванта мертиолата натрия в разведении 1100 на 10 мл сыворотки (конечное разведения мертиолата натрия 11000). Затем сыворотку адсорбируют 50-ной взвесью формалинизированных эритроцитов барана из расчета 0,1 мл на 1 мл сыворотки. Смесь встряхивают и оставляют в холодильнике при(4-2)С на 18-20 часов до полного оседания эритроцитов при (22-4)С, либо центрифугируют при 1200 об/мин в течение 10-15 минут. Надосадочную жидкость исследуют в РНГА. Рекомендуется использовать парные сыворотки крови больных животных в динамике заболевания. Первую сыворотку следует брать в начале заболевания, вторую - спустя 7-10 дней. Учет результатов. При положительном результате эритроциты выстилают дно лунки широким равномерным слоем, напоминающим опрокинутый зонтик. При отрицательном результате эритроциты выпадают на дно лунки в виде плотного осадка - пуговка или узкого колечка с ровными краями. 5. Примеры экспериментально производственного исследования показали, что у всех заболевших (крупный рогатый скот и лошади) животных с характерной клиникой лептоспироза с лептоспирозным эритроцитарным сухим диагностикумом в течении двух часов подтвержден диагноз на лептоспироз в титре 11280 - 12560. Этот технический результат показывает о специфичности и высокой чувствительности лептоспирозного диагностикума. Примеры экспериментально-производственного исследования Пример 1. В с. Жанабазар Казугуртского района Южно-Казахстанской области в 2014 году заболело лептоспирозом 28 голов крупного рогатого скота с клиническими признаками лептоспироза (-40,8 С,пульс 74, дыхание 36, общее состояние угнетенное,конъюнктива анемична с желтушностью моча темно-красного цвета). Для лабораторного анализа была взята кровь и при исследовании сыворотки в РНГА с лептоспирозным антигенным эритроцитарным диагностикумом в течении двух часов все пробы дали положительные результаты в титре 12560, которые подтверждают у животных болезнь лептоспирозной этиологии. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Лептоспирозный, антигенный, эритроцитарный(сухой) диагностикум для экспресс-диагностики лептоспироза животных,включающий формалинизированные,танизированные эритроциты барана,нагруженные родоспецифическим антигеном с использованием штаммов лептоспир, отличающийся тем, что в качестве штаммов лептоспир применяют