Штамм A/Taraz/01/2009 M-8-11/ Д пандемического вируса гриппа A/H1N1, семейства Orthomyxoviridae рода Influenzavirus типа А подтипа H1N1, предназначенный для приготовления иммунобиологических препаратов против гриппа A/H1N1

(51) 12 7/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ родатипа А подтипа 11,предназначенный для приготовления отечественных иммунобиологических препаратов против гриппа/11. Изобретение относится к области вирусологии и представляет собой новый штамм пандемического вируса гриппа /11, репродуцированный на 10 суточных куриных эмбрионах (КЭ) с биологической и гемагглютинирующей активностью 7,25 ЭИД 50/см 3 и 8-9 2, соответственно. Тесты на бактериальную и грибковую контаминацию показали стерильность штамма в отношении бактериальных и грибковых микроорганизмов. Полученный штамм //01/2009 (11) пандемического вируса гриппа/11 депонирован в Коллекции микроорганизмов Республиканского государственного предприятия Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан (РГП НИИПББ КН МОН РК) под регистрационным номером М-8-11/Д и хранится в нативном виде при минус 70 С в криопробирках. Жизнеспособность штамма в стабильном состоянии поддерживается путем освежения на 10-суточных КЭ каждые 2 года.(72) Орынбаев Мухит Бармакулы Мамбеталиев Муратбай Сансызбай Абылай Рысбайулы Керимбаев Аслан Амангельдиевич Табынов Кайрат Казыбаевич Копеев Сырым Калдыбаевич Азанбекова Молдир Абдилдаевна Мамадалиев Сейдигапбар Мамадалиевич(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан/11, СЕМЕЙСТВАРОДАТИПА А ПОДТИПА 11,ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ ГРИППА /11//01/2009 -8- 11/Д пандемического вируса гриппа /11, семейства Изобретение относится к области вирусологии и представляет собой новый штамм вируса гриппа/11, антигенно родственный вирусу гриппа свиней, который может быть использован для приготовления отечественных иммунобиологических препаратов против гриппа/11. Изобретение может быть использовано в вирусологических,серологических,иммунологических и молекулярно-биологических методах исследования. Целью настоящего изобретения является получение нового казахстанского штамма вируса гриппа /11, антигенно родственного свиному вирусу гриппа и предназначенного для приготовления антигенсодержащего субстрата в реакции торможения гемагглютинации (РТГА),иммуноферментном анализе(ИФА) для идентификации данного возбудителя и диагностики вызываемого им заболевания,определения рибонуклеиновой кислоты (РНК) вируса /11 в полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), а также приготовления вакцинных штаммов возбудителя. Сущность изобретения состоит в том, что впервые в Республике Казахстан в результате вирусологических исследований в декабре 2009 г. на 10- суточных куриных эмбрионах (КЭ) выделен пандемический вирус гриппа /11, антигенно родственный свиному, из носоглоточных смывов,отобранных от больной пациентки городской клинической больницы 2 г. Тараз Жидебаевой М. Штамм(11) обладает биологическими характеристиками, позволяющими использовать этот вирус для специфического выявления РНК пандемического вируса гриппа/11, подобного вирусу гриппа свиней с помощью ОТ-ПЦР,в конструировании рекомбинантных штаммов методом обратной генетики и разработке иммунобиологических препаратов(диагностических тест-систем,иммуноглобулина и вакцин), а также для оценки противовирусной активности различных лекарственных препаратов и новых соединений. В настоящем изобретении представлены антигенные,биологические и молекулярногенетические свойства этого вируса. Принадлежность выделенного штамма//01/2009 (11), антигенно родственного свиному вирусу гриппа, доказана методом ОТ-ПЦР в реальном времени, разработанной вдля типирования и субтипирования вирусов гриппа/11. После заражения КЭ материалом от больной максимальное накопление гемагглютинирующего агента с гибелью эмбрионов отмечено через 48 ч. Инфекционная активность составила 7,25 ЭИД 50/см 3 (эмбриональная инфекционная доза). Число пассажей к моменту паспортизации - 3. Выделенный штамм //01/2009 (11) пандемического вируса гриппа /11 аналогов в Республике Казахстан не имеет. Проведенный филогенетический анализ данного штамма 2 подтверждает происхождение пандемического вируса гриппа от вируса, сходного с типичным представителем североамериканской линии свиного гриппа /// 12439/00(12), являющимся тройным реассортантом классического свиного гриппа (1, , М и ),североамериканского гриппа птиц (РВ 2, РА) и человеческого гриппа 32 (РВ 1, 2). Известен штамм вируса гриппа //01/2009 (11) пандемического вируса гриппа /11, репродуцируемый в культуре клетокпри температуре 37 С в течение 4872 часов. Развитие цитопатического действия с полным разрушением монослоя отмечено через 72 часа после инфицирования. При этом инфекционная и гемагглютинирующая активность вируса через 48 часов не превышает 6,50 ТЦД 50/см 3 (тканевая цитопатическая доза),5,50(агглютинирующие единицы) соответственно. Не вызывает гибели белых крыс в модельных опытах при подкожном, внутримышечном и внутрибрюшинном способе введения.2412244 1, кл. 12 7/00, 2011 Приведенный выше аналог является наиболее близким предлагаемому нами изобретению по совокупности существенных признаков и признан в качестве прототипа. Особенностями выделенного штамма вируса гриппа //01/2009 (11) являются 1) различия по гену гемагглютинина от штамма/-/01/2009 (11) пандемического вируса гриппа /11 2) изоляция вируса на КЭ против стандартной культуры клетокдля штамма //01/2009 (11) пандемического вируса гриппа /11 3) взаимодействие с эритроцитами человека и кур в более высоких титрах в реакции гемагглютинации (РГА), в отличие от штамма/- /01/2009 (11) пандемического вируса гриппа /11. Предлагаемое изобретение включает штамм,совокупность существенных признаков которого обеспечивает получение следующих технических результатов 1) высокая способность продуцироваться в КЭ выделен из амниотической полости 10-суточных КЭ через 48 ч. при 37 С после заражения. Изолированный вирус характеризовался титром 1256-1512 АЕ. Инфекционный титр в КЭ через 48 ч. составил 7,25 ЭИД 50/см 3 2) контроль контаминации штамм не контаминирован микрофлорой,грибами,посторонними вирусами 3) способ хранения, в нативном виде. Эмбриональную вируссодержащую жидкость,разлитую в криопробирки замораживают при минус 70 С. Чувствительность штамма к этиотропным лечебным препаратам Выявлена его резистентность к ремантадину чувствительность к озельтамивиру (аминокислотная замена 275 в нейраминидазе не выявлена). Молекулярно-генетические свойства штамма Секвенирование полного генома пандемического вируса гриппа //01/2009 (11) показало отсутствие аминокислотных замен в вирионных белках М 2 и 2 по сравнению со штаммами вируса гриппа(11). Секвенированная последовательность М 2 белка штамма несла мутацию устойчивости к ремантадину, в положении 31 у него находится аспарагин вместо серина(31), характерную для всех циркулирующих в мире штаммови их предшественников по М гену штаммов евразийского свиного птицеподобного (- ) гриппа А. Выявлено наличие нескольких аминокислотных замен аминокислотных остатков в 1 белке по сравнению со штаммами вируса гриппа(131). Аминокислотной замены 275 (гистидин-тирозин) в последовательности гена нейраминидазы выявлено не было, однако обнаружена замена 248 (аспарагин аспарагиновая кислота), как и у штаммов(11). По гену гемагглютинина наибольшее сходство выявлено со штаммом вируса гриппа(11),выделенным в Японии. В аминокислотной последовательности гена гемагглютинина выявлено ряд замен 239 (аспарагиновая кислотаглицин),156 (аланинвалин) - уникальная и замена 338 (валин-изолейцин), характерная для штамма вируса гриппа //07/2009 (11). Все полученные последовательности генов были депонированы в Международную базу данных. С помощью международной базыопределен генотип нового штамма, который оказался смешанным и генетически отличным от человеческого сезонного вируса гриппа (11). Генотип казахстанского штамма вируса гриппа //01/2009 (11) составляет С, , Е, 1 , , , , 1 А генотипическую линию. Выделенный штамм //01/2009 (11) пандемического вируса гриппа/11 депонирован и хранится в Депозитарии возбудителей особо опасных инфекций Республиканского государственного предприятия Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан с регистрационным номером М-8-11/Д. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм //01/2009 пандемического вируса гриппа /11, семействарода подтипа 11,депонированный в РГП Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности КН МОН РК, под регистрационным номером -8-11/Д,предназначенный для приготовления иммунобиологических препаратов против гриппа