Штамм A/Astana/818/2009 (H1N1) M-10-11/ Д пандемического вируса гриппа A/H1N1, семейства Orthomyxoviridae рода Influenzavirus типа А подтипа H1N1, предназначенный для приготовления иммунобиологических препаратов против гриппа A/H1N1

(51) 12 7/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ предназначенный для приготовления иммунобиологических препаратов против гриппа/11. Изобретение относится к области вирусологии и представляет собой новый штамм пандемического вируса гриппа /11, репродуцированный на 10 суточных эмбрионах кур с биологической и гемагглютинирующей активностью 7,50 ЭИД 50/см 3 и 8 2,соответственно. Тесты на бактериальную и грибковую контаминацию показали стерильность штамма в отношении бактериальных и грибковых микроорганизмов. Полученный штамм //818/2009 (11) пандемического вируса гриппа/11 депонирован в Коллекции микроорганизмов Республиканского государственного предприятия Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан (РГП НИИПББ КН МОН РК) под регистрационным номером М-10-11/Д и хранится в нативном виде при минус 70 С в криопробирках. Жизнеспособность штамма в стабильном состоянии поддерживается путем освежения на 10-суточных куриных эмбрионах каждые 2 года.(72) Табынов Кайрат Казыбаевич Мамбеталиев Муратбай Сансызбай Абылай Рысбайулы Султанкулова Куляйсан Турлыбаевна Строчков Виталий Михайлович Ажибаев Азамат Жасуланович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан/11, СЕМЕЙСТВАРОДАТИПА А ПОДТИПА 11,ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ ГРИППА /11//818/2009 -10-11/Д пандемического вируса гриппа /11, семействародатипа А подтипа 11, 27049 Изобретение относится к области вирусологии и представляет собой новый штамм вируса гриппа/11, антигенно родственный вирусу гриппа свиней, который может быть использован для приготовления иммунобиологических препаратов против гриппа /11. Изобретение может быть использовано в вирусологических, серологических,иммунологических и молекулярно-биологических методах исследования. Целью настоящего изобретения является получение нового казахстанского штамма пандемического вируса гриппа /11, антигенно родственного свиному вирусу гриппа и предназначенного для приготовления антигенсодержащего субстрата в реакции торможения гемагглютинации(ИФА) для идентификации данного возбудителя и диагностики вызываемого им заболевания,определения рибонуклеиновой кислоты (РНК) вируса /11 в полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), а также приготовления вакцинных штаммов возбудителя. Сущность изобретения состоит в том, что впервые в Республике Казахстан в результате вирусологических исследований в июле 2009 г. на 10- суточных эмбрионах кур выделен пандемический вирус гриппа /11),антигенно родственный свиному, из образцов клинического материала (носоглоточные смывы),отобранных от людей с подозрением на инфицирование вирусом гриппа/11 сотрудниками РСЭС (республиканская санитарноэпидемиологическая станция) во время противоэпидемических мероприятий в г. Астана. Штамм(11) обладает биологическими характеристиками, позволяющими использовать этот вирус для специфического выявления РНК вируса пандемического гриппа/11, подобного вирусу гриппа свиней с помощью ОТ-ПЦР,в конструировании рекомбинантных штаммов методом обратной генетики и разработке иммунобиологических препаратов(диагностических тест-систем,иммуноглобулина и вакцин), а также для оценки противовирусной активности различных лекарственных препаратов и новых соединений. В настоящем изобретении представлены антигенные,биологические и молекулярногенетические свойства этого вируса. Принадлежность выделенного штамма//818/2009 (11), антигенно родственного свиному вирусу гриппа, доказана методом ОТ-ПЦР в реальном времени, разработанной вдля типирования и субтипирования вирусов гриппа/11. После заражения КЭ материалом от инфицированного человека максимальное накопление гемагглютинирующего агента с гибелью эмбрионов отмечено через 48 ч. Инфекционная активность составила 7,50 Число пассажей к моменту паспортизации - 4. Выделенный штамм //818/2009 (11) пандемического вируса гриппа /11 аналогов в Республике Казахстан не имеет. Проведенный филогенетический анализ данного штамма подтверждает происхождение пандемического вируса гриппа от вируса, сходного с типичным представителем североамериканской линии свиного гриппа /// 12439/00 (2),являющимся тройным реассортантом классического свиного гриппа),североамериканского гриппа птиц (РВ 2, РА) и человеческого гриппа 32 (РВ 1, 2). Уровень техники Известен штамм /-/01/2009 (11) пандемического вируса гриппа/11,репродуцируемый в культуре клетокпри температуре 37 С в течение 48-72 ч Пат.2412244 С 1, 30.07.2009., МПК 127/00. Развитие цитопатического действия с полным разрушением монослоя отмечено через 72 ч. после инфицирования. При этом инфекционная и гемагглютинирующая активность вируса через 48 ч. не превышает 6,50 ТЦД 50/см 3 (тканевая цитопатическая доза),5,50(агглютинирующие единицы) соответственно. Не вызывает гибели белых крыс в модельных опытах при подкожном,внутримышечном и внутрибрюшинном способе введения. Приведенный выше аналог является наиболее близким предлагаемому нами изобретению по совокупности существенных признаков и признан в качестве прототипа. Особенностями выделенного штамма вируса гриппа //818/2009 (11) являются 1) различия по гену нейраминидазы от штамма/-/01/2009 (11) пандемического вируса гриппа /11 2) изоляция вируса на КЭ против стандартной культуры клетокдля штамма //01/2009 (11) пандемического вируса гриппа /11 3) взаимодействие с эритроцитами человека и кур в более высоких титрах в реакции гемагглютинации (РГА), в отличие от штамма/- /01/2009 (11) пандемического вируса гриппа /11. Предлагаемое изобретение включает штамм,совокупность существенных признаков которого обеспечивает получение следующих технических результатов 1) высокая способность продуцироваться в КЭ выделен из амниотической полости 10-ти суточныхэмбрионов кур через 48 ч. при 35 С после заражения. Изолированный вирус характеризовался титром 1256 АЕ. Инфекционный титр в КЭ через 48 ч. составил 7,50 ЭИД 50/см 3 2) контроль контаминации штамм не контаминирован микрофлорой,грибами,посторонними вирусами 3) способ хранения, в нативном виде. Эмбриональную вируссодержащую жидкость, 27049 разлитую в криопробирки замораживают при минус 70 С. Чувствительность штамма к этиотропным лечебным препаратам. Выявлена его резистентность к ремантадину(аминокислотная замена 31 в М 2 белке), высокая чувствительность к озельтамивиру (аминокислотная замена 275 в нейраминидазе не выявлена). Молекулярно-генетические свойства штамма Анализ выравнивания аминокислотных последовательностей белков 2,и М 2 штамма//818/2009 (11) пандемического вируса гриппа /11 выявил отсутствие аминокислотных замен в белке 2 по сравнению со штаммами вируса гриппа//07/2009 (11). Все секвенированные последовательности М 2 белка штамма несли мутацию устойчивости к ремантадину, в положении 31 у него находится аспарагин вместо серина(31), характерную для всех циркулирующих в мире штаммови их предшественников по М гену штаммов евразийского свиного птицеподобного (-) гриппа А. При сравнении аминокислотных последовательностей гена нейраминидазы пандемических штаммов вируса гриппа со штаммом //818/2009(11) существенных аминокислотных замен выявлено не было, однако выявлено большое количество замен по сравнению с сезонным вирусом гриппа (//47/2008, //151/2009 и//08/2008). У проанализированного штамма показано наличие нескольких аминокислотных замен аминокислотных остатков в 1 белке по сравнению со штаммами вируса гриппа//818/2009 (11) показал, что данные последовательности гена гемагглютинина генетически подобны гену гемагглютинина штаммов вируса гриппа //05/2009 (11) и//07/2009 (11). Все полученные последовательности генов были депонированы в Международную базу данных . С помощью международной базыАопределен генотип нового штамма, который оказался смешанным и генетически отличным от человеческого сезонного вируса гриппа (11). Генотип казахстанского штамма вируса гриппа/11 депонирован и хранится в Депозитарии возбудителей особо опасных инфекций Республиканского государственного предприятия Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан с регистрационным номером М-10-11/Д. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Штамм(11) пандемического вируса гриппа /11, семействародатипаподтипа 11,депонированный в РГП Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности КН МОН РК, под регистрационным номером-10-11/Д,предназначенный для приготовления иммунобиологических препаратов против гриппа