Способ постановки реакции агглютинации при диагностике бруцеллеза животных

(51) 61 39/10 (2011.01) 01 33/53 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, а именно к приготовлению реагентов для серологических исследований бруцеллза животных. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в повышении точности диагностики бруцеллза животных. Способ постановки реакции агглютинации при диагностике бруцеллза животных путем иммунологического исследования сывороток крови животных с единым бруцеллзным антигеном в электролитной среде,включающей фенолизированный раствор хлорида натрия, в качестве электролитной среды используют стерильный генцианвиолетизированный раствор хлорида натрия.(72) Барамова Шолпан Аузаровна Султанов Ахметжан Акиевич Мырзалиев Ахан Жахангерович Оспанов Ержан Калиолдинович(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научноисследовательский ветеринарный институт(56) Методические указания по лабораторной диагностике бруцеллеза// Ветеринарное законодательство Республики Казахстан, Астана,2005, с. 19-32(54) СПОСОБ ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ БРУЦЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, а именно к приготовлению реагентов для серологических исследований бруцеллза животных. Известен способ постановки реакции агглютинации при диагностике бруцеллза животных путм иммунологического исследования сывороток крови животных с единым бруцеллзным антигеном в электролитной среде, включающей фенолизированный раствор хлорида натрия Методические указания по лабораторной диагностике бруцеллза //Ветеринарное законодательство Республики Казахстан. - Астана,2005.-Т.3.-с.19-32. Недостатком известного способа является использование в электролитной среде сильнодействующего ядовитого вещества на организм работника лаборатории. Задачей изобретения является приготовление стабильных реагентов для реакции агглютинации с использованием специфического безвредного консерванта. Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в повышении точности диагностики бруцеллза животных. Способ постановки реакции агглютинации при диагностике бруцеллза животных путм иммунологического исследования сывороток крови животных с единым бруцеллзным антигеном в электролитной среде,включающей фенолизированный раствор хлорида натрия, в качестве электролитной среды используют стерильный генцианвиолетизированный раствор хлорида натрия. Способ постановки реакции агглютинации при диагностике бруцеллза животных иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Для приготовления 0,85 5,0 7,0 и 10,0-ного раствора электролитной среды берут 8,5 50,0 70,0 и 100,0 г хлорида натрия и растворяют при подогревании в 1000,0 см 3 дистиллированной воды в зависимости от вида исследуемого животного. После изготовления раствора хлорида натрия его стерилизуют в автоклаве при 0,5 атмосферах в течение 20 минут. Пример 2. Основной раствор генцианвиолета(1100) готовят следующим образом 1,0 г сухого генцианвиолета растворяют в 10,0 см 3 спирта,растирая в ступке и добавляют 90,0 см 3 дистиллированной воды. Затем фильтруют через бумажный фильтр. Пример 3. Для приготовления генцианвиолетизированного раствора хлорида натрия основной раствор генцианвиолета разбавляют в электролитной среде из расчета 110 000 - 1100 000 к общему объму и доводят рН раствора до 7,0-7,2. При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей, собак, пушных зверей и морских свинок для разведения испытуемых сывороток и антигена используют генцианвиолетизированный 0,85 раствор хлорида натрия, при исследовании сывороток крови овец, коз,буйволов используют - 5-ный, а верблюдов и оленей соответственно 7 и 10-ный генцианвиолетизированный раствор хлорида натрия. 2 Пример 4. Берут сыворотки крови в свежем или консервированном виде. Свежие сыворотки исследуют не позднее 2-3 суток с момента взятия крови. Сыворотки при хранении в холодильнике могут быть пригодны для исследования в течение 5-6 суток. Если возникает необходимость более длительного хранения,то их консервируют борной кислотой. Борную кислоту добавляют в сухом виде (2,0 по отношению к объму сыворотки). Консервированные борной кислотой сыворотки пригодны для исследования в течение 1 месяца со дня их консервирования. Мутные, проросшие, загнившие сыворотки, а также гемолизированные не исследуют. Пример 5. При каждой постановке реакции одновременно с испытуемыми пробами ставят контроль с позитивной бруцеллзной сывороткой,который получают путем гипериммунизации животных или от больного бруцеллзом животного и контроль с негативной сывороткой (сыворотка крови здоровых животных). Пример 6. Антиген бруцеллзный единый для диагностики бруцеллза сельскохозяйственных животных готовят из штамма бактерии 19, который представляет собой гомогенную взвесь инактивированных нагреванием и фенолом бруцелл в физиологическом растворе. Прогретую и проверенную на чистоту суспензию бруцелл разводят в стерильных условиях 0,5 фенолизированным физиологическим раствором рН 7,0-7,2 до содержания 30 млрд. микробных тел в 1,0 см 3 по бруцеллезному стандарту мутности. Специфическая активность антигена стандартизируют по референтной агглютинирующей сыворотке, что позволяет выражать результаты реакции агглютинации в международных единицах антител на 1,0 см 3 сыворотки (например, сыворотка с конечным титром реакции агглютинации 1100 с оценкой два креста и более содержит 100 , 1200 200 и.т.д.). Перед употреблением антиген тщательно встряхивают. Пример 7. Реакцию ставят в объеме 1,0 см 3 в чистых стеклянных пробирках в четырех разведениях- при исследовании сывороток крови овец, коз,верблюдов, буйволов, оленей и собак - 125, 150,1100, 1200- пушных зверей и морских свинок - 110, 120, 140 и 180. Для исследования каждой испытуемой сыворотки расставляют в штативе по 5 пробирок. В пробирках первого ряда готовят основное разведение. Сыворотку крупного рогатого скота, лошадей берут в дозе 0,1 см 3 добавляют к ней 2,4 см 3 соответствующего раствора хлорида натрия (получают разведение 125). Сыворотку овец, коз, верблюдов, буйволов, оленей и собак берут в дозе 0,2 см 3 и добавляют 2,3 см 3 соответствующего раствора хлорида натрия(разведение 112,5), а сыворотку крови пушных зверей и морских свинок берут в дозе 0,3 см 3 и добавляют 1,2 см 3 соответствующего раствора хлорида натрия(разведение 15). Таким образом делают основное разведение испытуемых сывороток в пробирках первого ряда штатива (по 10 проб в ряду). После приготовления основного разведения сывороток в первом ряду, в пробирки третьего,четвертого и пятого рядов вливают по 0,5 см 3 соответствующего раствора хлорида натрия. Затем из пробирок первого ряда при помощи группового дозатора Флоринского переносят в пробирки второго и третьего рядов по 0,5 см 3 основного разведения сывороток (125, 112,5 или 15). В пробирках третьего ряда сыворотки смешивают с раствором хлорида натрия и 0,5 см 3 этого разведения переносят в пробирки четвертого ряда, где также смешивают и из этого разведения 0,5 см 3 переносят в пятый ряд. Из пробирок пятого ряда по 0,5 см 3 удаляют. Таким образом делают последовательное двукратное разведения одновременно 10 сывороток. После этого в каждую пробирку второго, третьего,четвртого и пятого рядов с разведнными сыворотками, вносят по 0,5 см 3 антигена,предварительно разбавленного в соотношении 110 соответствующим раствором хлорида натрия. После добавления антигена разведения сывороток в каждой пробирке удваивается и в зависимости от вида исследуемых животных будет составлять соотношения 125, 150, 1100, 1200 150, 1100, 1200 и 1400 или 110, 120, 140 и 180 в зависимости от вида исследуемых животных. В пробирки первого ряда бруцеллзный антиген не вносят и они служат контролем качества сыворотки. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты реакции агглютинации не учитывают. При массовых исследованиях допускается постановка реакции в первых двух разведениях. Сыворотки, давшие агглютинацию в каком-либо одном из указанных разведений, исследуют повторно в четырх разведениях. При каждой постановке реакции одновременно с испытуемыми пробами ставят контрольные реакции с негативной сывороткой в тех же разведениях, как испытуемые, а также с позитивной сывороткой до е предельного титра. После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам антигена штативы осторожно встряхивают и помещают в термостат при температуре 37-38 С на 16-20 часов, затем выдерживают при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего проводят учт реакции. Пример 8. Методика учта реакции агглютинации в пробирках. Результаты реакции учитывают визуально и определяют в крестах по схеме(4 креста) - полное просветление жидкости,агглютинат оседает на дно пробирки в виде зонтика(100,0 агглютинация)(3 креста) - неполное просветление жидкости,и хорошо выраженный зонтик (75,0 агглютинация)(2 креста) - просветление жидкости, зонтик умеренно выражен (50,0 агглютинация)(1 креста) - слабозаметное просветление жидкости, зонтик выражен очень слабо (25,0 агглютинация)- (минус) - осадок отсутствует, жидкость равномерного цвета. За титр антител принимают последнее разведение сыворотки, в котором произошла агглютинация не менее чем на 2 креста, что соответствует количеству международных единицантител в 1,0 см 3 сыворотки (например, сыворотка с конечным титром реакции агглютинации 1100 содержит 100 , 1200 200 и так далее). Пример 9. Диагностическая оценка результатов реакции агглютинации. Результаты реакции считают положительным при наличии агглютинации с сыворотками крови коз, овец, оленей и собак начиная с разведения 150 (50 ), крупного рогатого скота,лошадей и верблюдов - с разведения 1100 (100 ),пушных зверей и морских свинок - с разведения 110(10 ) с оценкой не менее чем на 2 креста. Результат реакции считают сомнительным при наличии агглютинации только в разведении 125 с сыворотками коз, овец, оленей и собак и в разведении 150 с сыворотками крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов с оценкой не менее чем на 2 креста. При получении сомнительного результата реакции сыворотку крови данного животного исследуют повторно через 3-4 недели и если получена дважды сомнительный результат реакции агглютинации относят к положительно реагирующим. В заключении лаборатории о результатах исследовании сообщают диагностическую оценку каждой пробы (положительная, сомнительная,отрицательная) и конечное разведение (титр) сыворотки, в котором получен соответствующий результат выраженное в . Использование способа постановки реакции агглютинации при диагностике бруцеллза позволит проводить эффективно серологические исследования больных и подозрительных по заболеванию бруцеллзом животных в ветеринарных лабораториях и обезопасить от отравления сильнодействующим ядовитым веществом персонал лаборатории. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ постановки реакции агглютинации при диагностике бруцеллеза животных путем иммунологического исследования сывороток крови животных с единым бруцеллезным антигеном в электролитной среде, включающей фенолизированный раствор хлорида натрия, отличающийся тем, что в качестве электролитной среды используют стерильный генцианвиолетизированный раствор хлорида натрия.