Способ приготовления туберкулёзного антигена для иммунизации лабороторных животных

(51) 61 39/04 (2009.01) 61 37/04 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Технический результат,обеспечиваемый изобретением, выражается в совершенствовании и ускорении процесса иммунизации животных и в получении сывороток с лучшей иммуногенностью. Способ приготовления туберкулезного антигена для иммунизации лабораторных животных,включающий выращивание бактериальной массы на синтетической среде Сотона, осаждение ее центрифугированием, ультразвуковую дезинтеграцию, осаждение протеиновой фракции изоэлектрическим фокусированием при рН 4,0, растворение полученного осадка в 0,5 раствором фенола и доведение концентрации белка до 0,6-0,7 мг/см 3,предварительно добавляют неполный адъювант Фрейнда к бактериальной массе, гомогенизацию смеси проводят ультразвуковой дезинтеграцией на аппарате УЗДН-1 в течение 20 мин с частотой колебаний 22 кГц и интенсивностью 100 Вт/см 2.(72) Сырым Назым Сырымкызы Тургенбаев Кайрат Алтынбекович Жанузаков Айнурбек Нурманович Шалабаев Болат Абуович Шокубасов Валихан Баялыевич(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт(56) Ходун Л.М. и др. Иммуноферментный анализ для диагностики туберкулеза животных. Методические рекомендации. Омск, 1990, с.2-5(54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ТУБЕРКУЛЗНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ ИММУНИЗАЦИИ ЛАБОРОТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ(57) Изобретение относится к области ветеринарной иммунологии и может быть использовано для проведения иммунизации кроликов с целью получения гипериммунных сывороток. 22262 Изобретение относится к области ветеринарной иммунологии и может быть использовано для изготовления антигенов из микобактерий с целью проведения иммунизации животных и получения гипериммунных сывороток. Известен способ приготовления туберкулезного антигена для иммунизации лабораторных животных, включающий выращивание бактериальной массы на синтетической среде Сотона, осаждение ее центрифугированием, ультразвуковую дезинтеграцию, осаждение протеиновой фракции изоэлектрическим фокусированием при рН 4,0, растворение полученного осадка в 0,5 раствором фенола и доведение концентрации белка до 0,6-0,7 мг/см 3 Л.М. Ходун и др., Иммуноферментный анализ для диагностики туберкулеза животных. Методические рекомендации. Омск, 1990. - с.2-5. Недостатком данного способа является низкая напряженность иммунитета у подопытных животных. Задачей изобретения является разработка способа приготовления туберкулезного антигена для иммунизации подопытных животных. Технический результат, обеспечиваемый изобретением, выражается в приготовлении антигена,способствующих повышенной напряженности иммунитета у подопытных животных и получению от этих животных гипериммунных сывороток с высоким титром антител. Способ приготовления туберкулезного антигена для иммунизации лабораторных животных,включающий выращивание бактериальной массы на синтетической среде Сотона, осаждение ее центрифугированием, ультразвуковую дезинтеграцию, осаждение протеиновой фракции изоэлектрическим фокусированием при рН 4,0, растворение полученного осадка в 0,5 раствором фенола и доведение концентрации белка до 0,6-0,7 мг/см 3,предварительно добавляют неполный адъювант Фрейнда к бактериальной массе, гомогенизацию смеси проводят ультразвуковой дезинтеграцией на аппарате УЗДН-1 в течение 20 мин с частотой колебаний 22 кГц и интенсивностью 100 Вт/см 2. Для изготовления туберкулезного антигена используют штамм-8. Указанный штамм микобактерии депонирован в Лаборатории по изучению генофонда микроорганизмов ТОО Казахский научноисследовательский ветеринарный институт. Морфологические признаки. При микроскопии мазков, окрашенных по Циль - Нильсену, микобактерии-8 обнаруживаются в виде прямых, коротких, с обрубленными концами тонких красных палочек, 0,3-0,6 мкм толщиной и 1,5-2 мкм длиной. Внутри клеток на концах иногда находятся включения - зерна Мухи, расположенные на концах микобактерий. В мазках из патологического материала,наряду с коккоподобными формами могут присутствовать и более длинные формы. Культуральные свойства. В аэробных условиях хорошо растут, в глицерине не нуждаются, дают отрицательный ниациановый тест. Оптимальная 2 температура роста 38-39 С.-8 на плотных яичных питательных средах растут медленно на 20-60 сутки, в виде мелких,шаровидных колонии цвета слоновой кости. Реже встречаются культуры, образующие морщинистые колонии. На жидких средах растут в виде отдельных островков, постепенно сливающихся в сплошную пленку. На полужидких средах дают рост в глубине среды. Биохимические свойства. Обладает дегидрогеназной и каталазной активностью. Патогенные свойства. Высоко патогенен для кроликов и морских свинок. При заражении у них вызывает генерализованный туберкулезный процесс. Физиолого-биохимические свойства. Хемегетеротрофы. Тип катоболизма - аэроб. Оптимальный рН 7,0-7,2. Источник углерода - глицерин. Источники азота - -аспарагин, Аммоний сернокислый. Источники серы - Сернокислый магний. Физиологические маркерные признаки хемегетеротроф, не растет без органических источников азота, к разным бактериальным препаратам чувствителен. Хранение на питательной среде - на среде Левенштейна-Йенсена, Гельберга при 4-6 С в течение 6 мес, максимальная продолжительность сохранения жизнеспособности хорошая, при хранении сохраняется жизнеспособность микобактерий. Изобретение осуществляется следующим образом. Пример 1. Бактериальную массу из штамма-8 отжимают на фильтровальной бумаге, затем из нее готовят суспензию из расчета 1 г бактериальной массы в 100 см 3 физиологического раствора. После этого проводят ультразвуковую дезинтеграцию бактериальной массы в режиме 22 кГц и интенсивностью 100 Вт/см 2 в течение 10 мин на аппарате УЗДН-1. Озвученный антиген фильтруют через 3 слоя стерильной марли во флакон, содержание белка в полученной серий антигена до 0,6-0,7 мг/см 3 определяют по Лоури с применением спектрофотометра СФ-430, затем закатывают резиновой пробкой, закатывают и инактивируют при температуре 85 С в течение 30 мин. Пример 2. Состав неполного адъюванта Фрейнда вазелин чистый (медицинский), ланолин безводный, некробактерин. Для приготовления адъюванта, вазелин и ланолин смешивают в соотношении 11. Добавление некробактерина осуществляют в пропорции 1 г на кг адъюванта Фрейнда. Добавление адъюванта к бактериальной взвеси проводят в пропорции 11, что пролонгирующие действие введенного антигена и замедляет снижение титра антител в организме иммунизированных кроликов. При этом смешивание адъюванта с антигенами производят с применением ультразвуковой 22262 дезинтеграции на аппарате УЗДН-1 в режиме,частотой 22 кГц и интенсивностью 100 Вт/см 2 в течение 10 мин. Исследование посредством РП сывороток крови,полученных в результате проведения иммунизации кроликов с использованием неполного адъюванта Фрейнда, показало достаточно высокий титр антител в них (до 164). После чего проводят исследование полученных сывороток с помощью ИФА. В результате был определен титр антител в сыворотках, в разведении 12 равный 17680, а в сыворотках в разведении 1100-16400. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о достаточной эффективности приведенного способа приготовления туберкулезного антигена из штамма-8 для иммунизации кроликов, что позволяет применению в лабораторной практике с целью получения гипериммунных сывороток для проведения серологических реакций в диагностике туберкулеза. Применение предлагаемого способа приготовления туберкулезного антигена из штамма-8 для иммунизации кроликов в лабораторной практике с целью получения гипериммунных сывороток для проведения серологических реакций в диагностике туберкулеза. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ приготовления туберкулзного антигена для иммунизации лабораторных животных,включающий выращивание бактериальной массы на синтетической среде Сотона, осаждение ее центрифугированием, ультразвуковую дезинтеграцию,осаждение протеиновой фракции изоэлектрическим фокусированием при рН 4,0,растворение полученного осадка 0,5 раствором фенола и доведение концентрации белка до 0,6-0,7 мг/см 3, отличающийся тем, что предварительно добавляют неполный адъювант Фрейнда к бактериальной массе,гомогенизацию смеси проводят ультразвуковой дезинтеграцией на аппарате УЗДН-1 в течение 20 мин с частотой колебаний 22 кГц и интенсивностью 100 Вт/ см 2.