Консорциум штаммов Acinetobacter calcoaceticus 2A и Microbacterium lacticum 41-3, используемый для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов

(51) 12 1/20 (2006.01) 12 1/26 (2006.01) 09 1/10 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ ЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ(57) Изобретение относится к области биотехнологии и экологии и может быть использовано для очистки почвенных экосистем от нефти и нефтепродуктов. Задачей изобретения является получение нового консорциума микроорганизмов-деструкторов с высокой углеводородокисляющей активностью,способного утилизировать нефть и нефтепродукты. В состав консорциума входят штаммы 2 и 41-3 выделенные из почв с хроническим нефтяным загрязнением. Предлагаемый консорциум активно утилизирует нефть и нефтепродукты. В модельных экспериментах снижает концентрацию нефти в почве при 5 загрязнении на 69,8 и при 10 загрязнении - на 64,4 за 3 месяца, что улучшает экологическую обстановку окружающей среды.(72) Саданов Аманкелди Курбанович Айткельдиева Светлана Айткельдиновна Ауэзова Ольга Николаевна Файзулина Эльмира Рамазановна Курманбаев Аскар Абылайканович(73) Дочернее государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт микробиологии и вирусологии Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Центр биологических исследований Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан 41-3,ИСПОЛЬ 22177 Изобретение относится к области биотехнологии и экологии и может быть использовано для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов. Известна ассоциация штаммов микроорганизмов-деструкторов. 14 Н, . 13,. 15,. 3,. 3 Н, используемая для ремедиации водоемов и почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами (патент РФ 2266958, 12, 2005). Недостатком данной ассоциации микроорганизмов является неспособность осуществлять утилизацию нефти и нефтепродуктов при высоком содержании их к объему загрязненного объекта. Известна биологически активная композиция для очистки поверхностных вод, почв и грунтов от нефтяных загрязнений (патент РФ, 2270808, 02,2006). Консорциум содержит штаммы.ВСБ-753,ВСБ 754,ВСБ-712,7 в объемном соотношении между собой 1111. Недостатком данной композиции микроорганизмов является неспособность осуществлять очистку почвы от нефти в условиях аридного климата с высокими температурами. Задачей изобретения является получение нового консорциума микроорганизмов-деструкторов с высокой углеводородокисляющей активностью,способного утилизировать нефть и нефтепродукты. В состав консорциума входят штаммы 2 и 41-3. Штаммы, входящие в консорциум выделены из почв с хроническим нефтяным загрязнением. Штамм 2 ИМиВ В 63 выделен из нефтезагрязненной почвы Атырауской области. Штамм представляет собой неподвижные палочки 1,252,5-3 мкм. Грамотрицательные, некислотоустойчивые, спор не образуют. На МПА и РПА культура образует округлые, выпуклые бежевопалевые колонии диаметром 3-5 мм. Край колоний ровный, пигментов в среду не выделяет. Аэроб. При росте в МПБ происходит помутнение среды, выпадает осадок, на поверхности образуется сплошная пленка. Штамм не токсичен и не патогенен. Физиолого-биохимические признаки В качестве источника углерода использует глюкозу, лактозу, маннозу. Крахмал не гидролизует,желатину не разжижает. Сероводород образует, индол не образует. Нитраты восстанавливает до нитритов. Дает положительную реакцию на каталазу и отрицательную на оксидазу. Культуру выращивают и хранят на косяках МПА или РПА. Температура хранения 4 С, пересев через 2 месяца. Штамм характеризуется высокой способностью к утилизации нефти и нефтепродуктов. Штамм бактерий 2 депонирован в коллекции Института микробиологии и вирусологии МОН РК под номером ИМиВ В-63 и в 2 Республиканской коллекции микроорганизмов НЦБ РК под номером В-0186. Штамм 41-3 выделен из нефтезагрязненной почвы Атырауской области. Штамм представляет неподвижные палочки, 0,61,252,5-3,1 мкм. Грамположительные,некислотоустойчивые, спор не образуют. На МПА и РПА культура - образует округлые, выпуклые колонии белого цвета, диаметром 3-5 мм. Край колоний ровный, пигментов в среду не выделяет. Аэроб. При росте в МПБ наблюдается помутнение среды, выпадает осадок, на поверхности образуется кольцеобразная пленка. Штамм не токсичен и не патогенен. Физиолого-биохимические признаки В качестве источника углерода использует глюкозу, лактозу, маннозу с образованием кислоты. Крахмал не гидролизует, желатину разжижает. Сероводород образует, индол не образует. Нитраты не восстанавливает. Дает положительную реакцию на каталазу и отрицательную на оксидазу. Культуру выращивают и хранят на косяках МПА или РПА. Температура хранения 4 С, пересев через 2 месяца. Штамм характеризуется высокой способностью к утилизации нефти и нефтепродуктов. Штамм бактерий 41-3 депонирован в коллекции Института микробиологии и вирусологии МОН РК под номером ИМиВ В-69. Консорциум состоит из суспензии клеток 2 и 41-3, выращенных на среде РПА. Суспензию бактерий получают путем смыва с поверхности скошенной среды 5 мл стерильной среды ВД в соотношении 11. Состав среды ВД, г/л дистиллированной воды 43 - 1,0 К 2 НРО 4 -1,0 КН 2 РО 4 - 1,0 4. 72 - 0,2 СаС 12 - 0,02 4 - следы, рН среды 7,0-7,2. Условия хранения консорциума и составляющих его штаммов. Консорциум сохраняют на жидкой среде ВД с 1 нефти при 4 С и производят пересевы через 1 месяц, при этом культуры сохраняют высокую нефтеокисляющую активность. В лабораторных условиях штаммы 2 и 41 -3 поддерживаются на косяках с РПА и пересеваютсячерез 1 месяц. Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами. Пример 1. В сосуды вносят по 100 г почвы, 10 г цеолита, азот и фосфор в виде (4)24, 5 и 10 нефти. Культуры активных нефтеокисляющих микроорганизмов выращивают на косяках РПА,затем стерильной средой ВД делают смывы в стерильную посуду. Полученную суспензию вносят по 25 мл в каждый сосуд с загрязненной почвой. Почву периодически взрыхляют и увлажняют. Через 1 и 3 месяца проверяют утилизирующую способность, как консорциума, так и отдельных штаммов, входящих в него. С этой целью почвенные образцы экстрагируют гексаном и хлороформом. Количество остаточной нефти определяют 22177 гравиметрическим методом. Результаты представлены в таблице 1. Через 1 месяц в контрольном варианте 1 в почве с 5 загрязнения естественная. утилизация составила 26,6, а при добавлении цеолита и удобрений(контроль 2) 31,7. Внесение консорциума активных нефтеокисляющих микроорганизмов в почву способствовало снижению содержания нефти на 21 по отношению к контролю 2. Через 3 месяца количество утилизированной нефти в контрольных вариантах составило 36,4 и 44,6, тогда как в опытных образцах - 69,8. При 10 загрязнении степень деградации нефти через месяц после внесения консорциума составила 49,8, а через три месяца - 64,4. Пример 2. Утилизация нефтепродуктов консорциумом штаммов 2 и 41-3. Минеральную среду ВД разливают по 100 мл в колбы Эрленмейера объемом 750 мл и стерилизуют при 1 атм. 30 минут. Суспензию бактерий получают путем смыва с поверхности скошенной среды 5 мл стерильной воды и вносят в среду. В качестве единственного источника углерода добавляют дизельное топливо, керосин и бензин в количестве 3 по объему. Культивируют на качалке 220 об/мин при 28-30 С 7 суток. Накопление биомассы определяют с помощью ФЭК-56 М при длине волны 540 нм. Контролем служит минеральная среда с нефтепродуктами без бактерий. Полученные результаты (табл. 2) свидетельствуют о том, что предлагаемый консорциум способен активно потреблять дизельное топливо, керосин и бензин. Таким образом, предлагаемый консорциумом штаммов 2 и 41-3 способен утилизировать нефть, а также бензин, керосин и дизельное топливо. Данный консорциум может быть использован для очистки нефтезагрязненных почв. Таблица 1 Утилизация нефти отдельными штаммами и консорциумом микроорганизмов Кол-воутилизации остаточной нефти нефти, г через 1 месяц 5 нефти 2,7605 45,9 Кол-воутилизации остаточной нефти нефти, г через 3 месяца Таблица 2 Рост консорциума на нефтепродуктах Вариант ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Консорциум штаммов 2 (депонирован в коллекции ИМиВ МОН РК,В исх. 0,15 0,01 63 и в РКМ НЦБ РК,- 0186) и 41-3 (депонирован в коллекции ИМиВ МОН РК,В-69), используемый для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов.