Консорциум штаммов Microccus roseus 34, Rhodococcus maris 65 и Arthrobacter globiformis 44A, используемый для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов

(2006.01), 09 1/10// (12 1/20, 12 1265, 12 101, 12 106) (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к области биотехнологии и экологии и может быть использовано для очистки почвенных экосистем от нефти и нефтепродуктов. Задачей изобретения является получение нового консорциума микроорганизмов-деструкторов с высокой углеводородокисляющей активностью,способного утилизировать нефть и нефтепродукты. В состав консорциума входят штаммы 34,65 и 44, выделенные из почв с хроническим нефтяным загрязнением. Предлагаемый консорциум активно утилизирует нефть и нефтепродукты. В модельных экспериментах снижает концентрацию нефти в почве при 5 загрязнении на 72,0 и при 10 загрязнении - на 64,2 за 3 месяца, что улучшает экологическую обстановку окружающей среды.(72) Саданов Аманкелди Курбанович Айткельдиева Светлана Айткельдиновна Файзулина Эльмира Рамазановна Ауэзова Ольга Николаевна Курманбаев Аскар Абылайканович(73) Дочернее государственное предприятие Институт микробиологии и вирусологии Республиканского государственного предприятия на праве хозяйственного ведения Центр биологических исследований Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(56) Авторское свидетельство СССР 1493666,02 3/34, 1989 44,ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ 21710 Изобретение относится к области биотехнологии и экологии и может быть использовано для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов. Известна биологически активная композиция для очистки поверхностных вод, почв и грунтов от нефтяных загрязнений (патент РФ 2270808, 02,2006). Консорциум содержит штаммыВСБ-753,ВСБ-754,ВСБ-712,7 в объемном соотношении между собой 1111. Недостатком данной композиции микроорганизмов является неспособность осуществлять очистку почвы от нефти в условиях аридного климата с высокими температурами. Известна смесь специально селекционированных штаммов бактерийВКПМ(25) иВКПМ В-3079 (53) (а.с. СССР 1493666, 02 3/34, 1989), используемая для деструкции нефти и нефтепродуктов. Недостатком данной смеси микроорганизмов является использование указанных культур микроорганизмов только в аэротенках. Выращивание смеси культур возможно при больших материальных и энергозатратах. Задачей изобретения является получение нового консорциума микроорганизмов-деструкторов с высокой углеводородокисляющей активностью,способного утилизировать нефть и нефтепродукты. В состав консорциума, входят штаммы 34,65 и 44. Штаммы, входящие в консорциум выделены из почв с хроническим нефтяным загрязнением. Штамм 34 представляет собой кокки, одиночные, в парах и в скоплениях, 1,25-2,0 мкм. Грамположительные, некислотоустойчивые,спор не образуют. На МПА и РПА культура образует округлые, выпуклые колонии красного цвета, диаметром 1-2 мм. Край колоний ровный,пигментов в среду не выделяет. Аэроб. При росте в МПБ происходит помутнение среды, выпадает осадок, на поверхности образуется кольцевидная пленка. Штамм не токсичен и не патогенен. Физиолого-биоимтические признаки В качестве источника углерода использует глюкозу, лактозу, маннозу. Крахмал не гидролизует, желатину не разжижает. Сероводород и индол не образует. Нитраты восстанавливает до нитритов. Дает положительную реакцию на каталазу и оксидазу. Культуру выращивают и хранят на косяках МПА или РПА. Температура хранения 4 С, пересев через 2 месяца. Штамм характеризуется высокой способностью к утилизации нефти и нефтепродуктов. Штамм бактерий 34 депонирован в коллекции Института микробиологии и вирусологии МОН РК под номером ИМиВ В-67 и в Республиканской коллекции микроорганизмов НЦБ РК под номером В-0184. 2 Штамм 65 представляет собой кокки, прорастающие в палочки. Клетки неподвижные. Грамположительные, кислотоустойчивые, спор не образуют. На МПА и РПА культура образует округлые, выпуклые колонии оранжевого цвета,диаметром 2-3 мм. Край колоний ровный, пигментов в среду не выделяет. Аэроб. При росте в МПБ выпадает небольшой осадок, на поверхности образуется обильная сплошная пленка. Штамм не токсичен и не патогенен. Физиолого-биохимические признаки В качестве источника углерода использует глюкозу, лактозу, а маннозу с образованием кислоты. Крахмал не гидролизует, желатину не разжижает. Сероводород образует, индол не образует. Нитраты не восстанавливает. Дает положительную реакцию на каталазу и отрицательную на оксидазу. Культуру выращивают и хранят на косяках МПА или РПА. Температура хранения 4 С пересев через 2 месяца. Штамм характеризуется высокой способностью к утилизации нефтяных смесей и нефтепродуктов. Штамм бактерий 65 депонирован в коллекции ДГП Института микробиологии и вирусологии ЦБИ МОН РК под номером ИМиВ В 71 и в Республиканской коллекции микроорганизмов НЦБ РК под номером - 0185. Штамм 44- представляет собой кокки, прорастающие в палочки. Клетки неподвижные. Грамположительные, некислотоустойчивые, спор не образуют. На МПА и РПА культура образует округлые, выпуклые колонии красного цвета, диаметром 2-3 мм. Край колоний ровный,пигментов в среду не выделяет. Аэроб. При росте в МПБ наблюдается помутнение среды, выпадает осадок, на поверхности образуется кольцевидная пленка. Штамм не токсичен и не патогенен. Физиолого-биохимические признаки В качестве источника углерода использует глюкозу, лактозу и маннозу. Крахмал не гидролизует, желатину не разжижает. Сероводород и индол не образует. Нитраты восстанавливает до нитритов. Дает положительную реакцию на каталазу и отрицательную на оксидазу. Культуру выращивают и хранят на косяках МПА или РПА. Температура хранения 4 С, пересев через 2 месяца. Штамм характеризуется высокой способностью к утилизации нефти и нефтепродуктов. Штамм бактерий 44 депонирован в коллекции Института микробиологии и вирусологии МОН РК под номером ИМиВ В-70 и в Республиканской коллекции микроорганизмов НЦБ РК под номером В- 0187. Консорциум состоит из суспензии клеток 34,65 и 44, выращенных на среде РПА. Суспензию бактерий получают путем смыва с поверхности скошенной среды 5 мл стерильной среды ВД в соотношении 111.- 0,2 СаС 12 - 0,02 4 - следы, рН среды 7,0-7,2. Условия хранения консорциума и составляющих его штаммов. Консорциум сохраняют на жидкой среде ВД с 1 нефти при 4 С и производят пересевы через 1 месяц, при этом культуры сохраняют высокую нефтеокисляющую активность. В лабораторных условиях штаммы 34,65 и 44 поддерживаются на косяках с РПА и пересеваются через 1 месяц. Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами. Пример 1. В сосуды вносят по 100 г почвы, 10 г цеолита, азот и фосфор в виде (4)24, 5 и 10 нефти. Культуры активных нефтеокисляющих микроорганизмов выращивают на косяках РПА,затем стерильной средой ВД делают смывы в стерильную посуду. Полученную суспензию вносят по 25 мл в каждый сосуд с загрязненной почвой. Почву периодически взрыхляют и увлажняют. Через 1 и 3 месяца проверяют утилизирующую способность, как консорциума, так и отдельных штаммов, входящих в него. С этой целью почвенные образцы экстрагируют гексаном и хлороформом. Количество остаточной нефти определяют гравиметрическим методом. Результаты представлены в таблице 1. Через 1 месяц в контрольном варианте 1 в почве с 5 загрязнения естественная утилизация составила 26,6, а при добавлении цеолита и удобрений(контроль 2) - 31,7. При внесении консорциума активных нефтеокисляющих микроорганизмов в почву содержание нефти снизилось на 53,5. Через 3 месяца количество утилизированной нефти в контрольных вариантах составило 36,4 и 44,6, тогда как в опытных образцах - 72,0. При 10 загрязнении степень деградации нефти через месяц после внесения консорциума составила 48,3, а через три месяца - 64,2. Пример 2. Утилизация нефтепродуктов консорциумом штаммов 34,65 и 44. Минеральную среду ВД разливают по 100 мл в колбы Эрленмейера объемом 750 мл и стерилизуют при 1 атм. 30 минут. Суспензию бактерий получают путем смыва с поверхности скошенной среды 5 мл стерильной воды в соотношении 111 и вносят в среду. В качестве единственного источника углерода добавляют дизельное топливо, керосин и бензин в количестве 3 по объему. Культивируют на качалке 220 об/мин при 28-30 С 7 суток. Накопление биомассы определяют с помощью ФЭК-56 М при длине волны 540 нм. Контролем служит минеральная среда с нефтепродуктами без бактерий. Полученные результаты (табл. 2) свидетельствуют о том, что предлагаемый консорциум способен активно потреблять дизельное топливо, керосин и бензин. Таким образом, предлагаемый консорциумом штаммов 34,65 и 44 способен утилизировать нефть, а также бензин, керосин и дизельное топливо. Данный консорциум может быть использован для очистки нефтезагрязненных почв. Таблица 1 Утилизация нефти отдельными штаммами и консорциумом микроорганизмов Вариант Кол-во Кол-воутилизации Кол-во Кол-во внесенной остаточной нефти внесенной остаточной утилизации нефти, г нефти, г нефти, г нефти, г нефти через 1 месяц через 3 месяца 5 нефти 5,0921 2,8414 44,2 5,1563 1,9955 61,3 345,1436 3,0553 40,6 5,0967 2,0132 60,5 65 21710 Таблица 2 Рост консорциума на нефтепродуктах Вариант ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Консорциум штаммов 34(депонирован в РКМ НЦБ РК,- 0187),используемый для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов.