Способ изготовления аллергена из бруцелл

(51) 61 39/10 (2006.01) 12 13/00 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ автоклавированием,удаление их центрифугированием и последующую стерилизующую фильтрацию,дезинтеграцию осуществляют ультразвуком при рН 9,0-10,0,дополнительно проводят удаление сенсибилизирующих начал путем снижения рН в полученном дезинтеграте трихлоруксусной кислотой до рН 5,0-6,0 затем осуществляют автоклавирование при 1,0-1,5 атмосфере в течение 20-30 минут, центрифугирование при 5-6 тыс. об/мин в течение 30-40 минут, с последующим доведением рН до 7,0 и стерилизующей фильтрацией через стерилизующий фильтр СФ 3. Предлагаемый способ позволяет получить бруцеллезный аллерген,не обладающий сенсибилизирующими свойствами, повысить выход активного начала и сократить время изготовления препарата.(72) Иванов Николай Петрович Хусаинов Дамир Микдатович(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Вита-СТ , Иванов Николай Петрович , Хусаинов Дамир Микдатович(56) Авторское свидетельство СССР 946040, кл. А 61 К 39/10, 1982(54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ АЛЛЕРГЕНА ИЗ БРУЦЕЛЛ(57) Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам получения биологических препаратов, и может быть использовано для изготовления бруцеллезных аллергенов,не обладающих сенсибилизирующими свойствами. Для достижения цели в способе изготовления аллергена из бруцелл, включающим дезинтеграцию бруцелл, денатурацию крупнодисперсных белков 20775 Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам получения биологических препаратов, и может быть использовано для изготовления бруцеллезных аллергенов,не обладающих сенсибилизирующими свойствами. Известен способ получения бруцеллезных аллергенов, включающий лизирование 100 млрд.ной взвеси бруцелл в стерильном физиологическом растворе с рН 7,0-8,0 воздействием ультразвуковых волн частотой 22 КГц, интенсивность 70-100 Вт/см 2,в течение одного часа,денатурацию крупнодисперсных белков автоклавированием при 1 атмосфере в течение 30 минут и удалением их центрифугированием или фильтрацией через фильтр Зейтца (Авторское свидетельство СССР 946040,кл. А 61 К 39/10, 1982). Недостатком этого метода получения аллергена из бруцелл является относительно малый выход активных начал, длительность и сложность процесса приготовления. Задачей изобретения является получение аллергена для диагностики бруцеллеза животных. Техническим результатом изобретения является ускорение процесса изготовления и снижение себестоимости готового препарата при сохранении достаточно высокой активности. Для достижения указанной цели в способе изготовления аллергена из бруцелл, включающим дезинтеграцию бруцелл,денатурацию крупнодисперсных белков автоклавированием,удаление их центрифугированием и последующую стерилизующую фильтрацию,дезинтеграцию осуществляют ультразвуком при рН 9,0-10,0,дополнительно проводят удаление сенсибилизирующих начал путем снижения рН в полученном дезинтеграте трихлоруксусной кислотой до рН 5,0-6,0 затем осуществляют автоклавирование при 1,0-1,5 атмосфере в течение 20-30 минут, центрифугирование при 5-6 тыс. об/мин в течение 30-40 минут, с последующим доведением рН до 7,0 и стерилизующей фильтрацией через стерилизующий фильтр СФ 3. Пример. Бруцеллы вида , например шт.424/2 или 10/2, или бруцеллы вида(при диагностике бруцеллеза овец),например шт.- 1,выращенные на эритрит-агаре, смывают стерильным физиологическим раствором поваренной соли,дважды отмывают им же от остатков питательной среды. Затем доводят до концентрации 50 млрд. микробных тел (по бруцеллезному стандарту мутности) 1/15 М фосфатным или 0,05 М трисбуфером (трис-буфер готовят следующим образом в мерной колбе на 1 литр вносят 6,057 г триса и доливают стерильной дистиллированной водой до метки рН -9,0-10,0). Полученную взвесь подвергают воздействию(с помощью ультразвукового диспергатора УЗДН-1 при частоте 22 кГц, мощности 100 Вт/см 2) ультразвуковых волн до просветления (10-15 минут). По окончании озвучивания в микробный дезинтеграт добавляют 20-ный раствор трихлоруксусной кислоты до рН 6,0 и подвергают автоклавированию при 1-1,5 атм,2 20-30 минут. Выпавший после автоклавирования осадок отделяют центрифугированием,а надосадочную часть доводят рН до 7,0, фильтруют через стерилизующий фильтр и используют в рабочем разведении (после предварительной титрации) в качестве аллергена. Установлено, что полученный описанным способом препарат способен вызывать аллергическую реакцию замедленного типа у животных,зараженных соответствующим возбудителем. Срок годности готового препарата не менее 18 месяцев. Активность и специфичность полученного описанным способом аллергена была проведена в лабораторных и производственных условиях. Полученные при этом данные указывают на высокую активность и специфичность препарата,что позволяет дополнительно выявлять до 10 больных животных. С целью определения наличия сенсибилизирующих и антигенных свойств ультразвукового овисного и бруцеллезного аллергенов препараты двух видов были введены двум группам кроликов, по 4 в каждой, в рабочем разведении в дозе 0,1 см 3, внутрикожно, по белой линии живота. Далее указанным животным было проведено 7 инъекций препарата с интервалом 12-20 дней. Параллельно, после каждого введения брали кровь для серологических исследований. Учет аллергических и серологических реакций производили по общепринятым методикам. При этом во всех случаях был получен отрицательный результат. При исследовании сывороток крови с официально принятыми в ветеринарной практике бруцеллезными антигенами также получены отрицательные результаты. Кроме того, препарат вводили 12 морским свинкам в те же сроки, что и кроликам, по той же схеме и в той же дозе. После 7 введений аллергических реакций не возникло. Таким образом, ультразвуковой аллерген из бруцелл видовипри внутрикожном введении в дозе 0,2 см 3 лабораторным животным(кролики,морские свинки) не проявлял сенсибилизирующих свойств. Эти же свойства изучали на благополучной по бруцеллезу и инфекционному эпидидимиту отаре овец. При этом 20 здоровым баранам и 60 здоровым овцам ввели соответственно овисный и бруцеллезный ультразвуковой аллерген в рабочем разведении в дозе 0,5 см 3 под кожу нижнего века левого глаза (интрапальпебральная проба). Учет реакций произвели через 48 часов. Нее животные реагировали отрицательно. Через 1,5 месяца после начала опыта у данных животных была взята кровь для серологических исследований с официально принятыми в ветеринарной практике бруцеллезными антигенами. Были получены отрицательные результаты. Кроме того, 15 здоровым овцам и 15 здоровым баранам осуществили 4-х кратное, с интервалом 10 20775 14 дней, введение ультразвуковых аллергенов в рабочем разведении в дозе 0,5 см 3 под кожу нижнего века левого глаза (интрапальпебральная проба), После каждого введения через 48 часов проводили учет реакции. Все животные реагировали отрицательно. Через 2,5 месяца после начала опыта у данных животных была взята кровь для серологических исследований с официально принятыми в ветеринарной практике бруцеллезными антигенами. Были получены отрицательные результаты. Следовательно, ультразвуковой аллерген из бруцелл видаине проявляет сенсибилизирующих и антигенных свойств при 4 кратном интрапальпебральном введении овцам в дозе 0,5 см 3. Специфичность препарата проверяли в сравнении с контрольным аллергеном. Аллергены применяли в пальпебральной пробе в дозе 0,5 см 3,Опыт проводили на овцах и баранах, диагноз на бруцеллез и инфекционный эпидидимит у которых был предварительно установлен серологическим путм (РСК, РДСК). Реакцию учитывали через 48 часов. В таблице 1 приведены результаты проверки специфичности препарата. Таблица 1 Сравнительная специфичность опытного и контрольного аллергенов из бруцелл Реагировало на Номер опыта Вид животных Вид аллергена Количество животных испытуемый коммерческий неблагополучных новый(прототип) стад 1 овцы из бруцелл 25 25 20 мелитензис 2 бараны из бруцелл 25 25 21 вида овис Как видно из данных таблицы 1, аллерген из бруцелла видапроявляет более высокую специфическую активность,чем общепринятый(коммерческий) аллерген,изготовленный из бруцелл видаи ,применяемый для диагностики бруцеллеза овец. Так же было проведено комплексное исследование на бруцеллез и инфекционный эпидидимит в двух неблагополучных по бруцеллезу отарах овец. Всего проведено комплексное(серологическое и аллергическое) исследование 245 овец и 179 баранов разных возрастов. При серологических исследованиях применялись официально утвержденные реакция агглютинации(РА), реакция связывания комплемента (РСК) с коммерческими бруцеллезными антигенами и реакция длительного связывания комплемента(РДСК) с коммерческим овисным антигеном. При аллергическом исследовании использовали аллерген из бруцелл видаи ,изготовленный путем дезинтеграции микробных клеток ультразвуком, В качестве контрольного аллергена был введен коммерческий бруцеллин. Оба аллергена вводили под кожу нижнего века левого(ультразвуковой бруцеллин) глаза в дозе 0,5 см 3 рабочего разведения (интрапальпебральная проба). В результате комплексного исследования выявлено наличие инфекционного эпидидимита у 23 баранов, что подтверждено в РДСК в 21 случае,тогда как в РДСК - 21 барана. При этом коммерческим аллергеном подтверждено 17 случаев. При исследовании на бруцеллез среди овец ультразвуковым бруцеллином выявлено 33 животных, тогда как аллергической реакцией на коммерческий бруцеллин - 27, на РА - 31, РСК -27. Следовательно, аллерген, изготовленный из бруцелл видаис применением ультразвука, позволяет выявить в неблагополучных отарах дополнительно к общепринятым серологическим (РДСК, РСК и РА) методам 10-30 животных,инфицированных возбудителем инфекционного эпидидимита и бруцеллеза. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ изготовления аллергена из бруцелл,включающий лизирование бруцелл, денатурацию крупнодисперсных белков автоклавированием, их удаление центрифугированием и стерилизующую фильтрацию, отличающийся тем, что лизирование осуществляют при рН 9,0-10,0, дополнительно проводят удаление сенсибилизирующих начал путем снижения рН в полученном дезинтеграте трихлоруксусной кислотой до 6,0 автоклавирование осуществляют при 1,0-1,5 атмосфере в течение 2030 минут, а стерилизующую фильтрацию осуществляют через фильтр СФ-3.