Способ получения гемолизина

(51) 61 35/16 (2006.01) 61 39/395 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ реакции связывания конглютинирующего комплекса. Способ получения гемолизина путем иммунизации кроликов иммунизацию кроликов осуществляют эмульсией эритроцитов с сочетанием подкожного и внутривенного введений, а за 7-10 дней до кровопускания, подкожно вводят тривитамин (комплекса витаминов А, Д, Е) в дозе 0,1 см 3 на 1 кг живой массы и 1 раствор аскорбиновой кислоты (витамина С) в дозе 0,1 см 3 на 1 кг живой массы, с последующим взятием крови и отделением сыворотки. Предлагаемый способ позволяет получить высокоактивную гемолитическую сыворотку гемолизин.(72) Иванов Николай Петрович Хусаинов Дамир Микдатович(73) Товарищество с ограниченной ответственностью ВИТА-СТ , Иванов Николай Петрович , Хусаинов Дамир Микдатович(56) Практикум по ветеринарной микробиологии,М., Агропромиздат, 1989, с. 127(57) Изобретение относится к иммунологии и серологии, в частности к производству гемолизина,используемого в качестве компонента при постановке реакции связывания комплемента и 20482 Изобретение относится к иммунологии и серологии, в частности к производству гемолизина,используемого в качестве компонента при постановке реакции связывания комплемента и реакции связывания конглютинирующего комплекса. Известен способ получения гемолизина путем иммунизации кроликов антигеном, приготовленным из эритроцитов, с последующим взятием крови и отделением сыворотки, при этом в качестве антигена используют отмытые эритроциты барана.(Практикум по ветеринарной микробиологии, М.,Агропромиздат, 1989, С. 127). Недостатком способа является то, что при иммунизации животных (путем внутривенного введения) эритроцитами не всегда достигается высокая активность препарата. Задачей изобретения является разработка более эффективного способа получения более активного гемолизина. Цель достигается путем иммунизации кроликов взвесью эритроцитов, при этом иммунизацию осуществляют комбинацией внутривенного и подкожного введения, с последующим взятием крови и отделением сыворотки, за 7-10 дней до кровопускания, осуществляют подкожное введение тривитамина (комплекса витаминов А, Д, Е) в дозе 0,1 см 3 на 1 кг живой массы и 1 раствора аскорбиновой кислоты (витамина С) в дозе 0,1 см 3 на 1 кг живой массы. Пример получения гемолизина А. Техника получения антигена. Взвесь эритроцитов готовят из крови барана. Для этого используют баранов из благополучных по инфекционным и инвазионным болезням хозяйств, с обязательным исследованием на бруцеллез и инфекционный эпидидимит. Кровь у баранов берут из яремной вены стерильной иглой в стерильную колбочку (флакон) со стеклянными (фарфоровыми) бусами или шариками с небольшим количеством изотонического раствора натрия хлорида (0,9). Кровь осторожно встряхивают круговыми движениями, образуются сгустки фибрина, которые удаляют путм процеживания через двойной слой марли. Жидкую часть (дефибринированную кровь) сливают в центрифужные пробирки, центрифугируют при 2,5-3,0 тыс.об/мин., надосадочную жидкость декантируют, а осадок ресуспендируют изотоническим раствором натрия хлорида, вновь центрифугируют с последующим отсасывнием надосадочной жидкости. Такое отмывание эритроцитов повторяют не менее трех раз, пока жидкость над осадком эритроцитов не станет прозрачной и не будет давать реакцию на белок (при добавлении конц. 3). Б. Техника иммунизации животных. Для получения гемолизина отбирают клинически здоровых кроликов, полученных из благополучных по инфекционным болезням кролиководческих ферм. Используют кроликов любой породы (кроме альбиносов) массой 1,5-2 кг. Иммунизацию кроликов осуществляют подкожными и внутривенными инъекциями. Внутривенное 2- в ушные вены, подкожное - в подушечки лапок всех четырех конечностей. К антигену, вводимому подкожно добавляли гель гидроокиси алюминия в соотношении 20-50, или вводили антиген состоящий из 1,5 частей ланолина, 1 части вазелинового масла, 1,5 частей физиологического раствора и 2 частей взвеси эритроцитов. В первый день иммунизации такая смесь вводилась подкожно в подушечки лапок по 0,2 см 3 в каждую и одновременно взвесь эритроцитов - внутривенно в дозе 0,5 см 3 (общая доза антигена 0,9 см 3). Иммунизацию осуществляли 4-6 кратно с интервалом 4-6 дней по схеме в подушечки лапок по 0,2 см 3 внутривенно - 1 инъекция 0,3-0,5 см 3, 2 инъекция 0,5-0,7 см 3, 3 инъекция 0,7-1,0 см 3, 4 инъекция 1,0-1,5 см 3, 5 инъекция 1,5-2,0 см 3. За 7-10 дней до кровопускания, осуществляют подкожное введение тривитамина (комплекса витаминов А, Д, Е) в дозе 0,1 см 3 на 1 кг живой массы и 1 раствора аскорбиновой кислоты(витамина С) в дозе 0,1 см 3 на 1 кг живой массы. На 6-8 день после последней иммунизации испытывают активность сыворотки, путем ее титрации в гемолитической системе. Для этого взятую кровь помещают на 30 минут в термостат при 37 С, а затем отделяли сгусток и помещали пробы в холодильник при 4-6 С на 14-20 часов после чего стерильно отсасывают прозрачную сыворотку, инактивируют ее (прогреванием при 50 С), консервируют глицерином 11 или 0,5 фенолом. Одновременно в качестве контроля использовались 10 кроликов, иммунизированных по общепринятой методике отмытыми эритроцитами барана. Кроликам 4-5 раз внутривенно вводили 4050 взвесь отмытых эритроцитов с 2-3 -дневным интервалом. Через неделю после последней инъекции у кроликов брали кровь, отсасывали сыворотку, инактивировали и титровали в гемолитической системе. В. Титрация гемолитической сыворотки(гемолизина). Титром гемолитической сыворотки считается то наибольшее разведение ее, которое растворяет эритроциты барана в присутствии комплемента. Схема титрации гемолизина приведена в таблице 1. Все пробирки встряхивают и помещают в водяную баню при 37-38 С на 10-15 мин. Учет результатов титрации начинают с пробирок с наибольшим содержанием гемолизина (наименьшим разведением), в пробирке с наименьшим количеством гемолизина, где произойдет гемолиз (лизис эритроцитов), жидкость станет красной и прозрачной, это количество принимают за предельный титр. В результате учета результатов титрации гемолизина у кроликов было установлено, что средний титр гемолизина был выше у кроликов опытной группы и составил в среднем 12200, тогда как у кроликов контрольной группы в среднем составил 11500. В дальнейшем, использование данной методики в производстве позволило получать высокоактивную гемолитическую сыворотку - гемолизин. 20482 Таблица Схема титрации гемолизина Изотонический раствор натрия хлорида, см 3 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения гемолизина, используемого в качестве компонента при постановке реакции связывания комплемента,включающий иммунизацию кроликов антигеном,приготовленным из эритроцитов барана, с последующим взятием крови и отделением 11000 1111 11250 11429 11666 12000 12500 13333 15000 110000 Контроль гемолитической сыворотки Контроль комплемента Контроль эритроцитов сыворотки, отличающийся тем, что иммунизацию продуцентов осуществляют эмульсией эритроцитов с сочетанием подкожного и внутривенного введений, а за 7-10 дней до взятия крови, подкожно вводят тривитамин - комплекс витаминов А, Д и Е, в дозе 0,1 см 3 на 1 кг живой массы, и 1 раствор аскорбиновой кислоты - витамин С, в дозе 0,1 см 3 на 1 кг живой массы.