Способ получения гемолизина для реакции связывания комплемента

КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕМОЛИЗИНА ДЛЯ РЕАКЦИИ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА(57) Изобретение относится к иммунологии и серологии, в частности к производству гемолизина, используемого в качестве компонента при постановке реакции связывания комплемента. Способ получения гемолизина для реакции связывания комплемента включает иммунизацию кроликов антигеном, приготовленным из эритроцитов барана, с последующим взятием крови и отделением сыворотки, причем перед проведением иммунизации кроликов обрабатывают 3-4-кратно цитотоксической сывороткой с интервалом 3-4 дня, а иммунизацию осуществляют путем комбинирования подкожного и внутривенного введения антигена, приготовленного из эритроцитов барана. Предложенный способ позволяет получить высокоактивную гемолитическую сывороткугемолизина(72) Ахметсадыков Нурлан Нуролдинович Хусаинов Дамир Микдатович Амиргазиев Ералы Куанышбаевич Иванов Николай Петрович(56) Костенко Т.С. и др. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии. М. Агропромиздат, 1989, с. 127 Биологические и химиотерапевтические ветеринарные препараты. М. Издательство сельскохозяйственной литературы, журналов и плакатов, 1963,с.342 Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования под ред. М.О.Биргера. М. Медицина, 1973, с. 140-141. 14296 Изобретение относится к иммунологии и серологии, в частности к производству гемолизина, используемого в качестве компонента при постановке реакции связывания комплемента. Известен способ получения гемолизина путем иммунизации кроликов отмытыми эритроцитами барана, взятием крови, отделением сыворотки(Практикум по ветеринарной микробиологии. М. Агропромиздат, 1989, с. 127). Недостатком способа является то, что полученная гемолитическая сыворотка не всегда содержит достаточно высокий титр гемолизинов, что может быть связано с низкой реактивностью организма животных-продуцентов гемолизина. Задачей изобретения является разработка способа получения гемолизина для реакции связывания комплемента, позволяющего получить высокоактивную гемолитическую сыворотку - гемолизина. Способ получения гемолизина для реакции связывания комплемента включает иммунизацию кроликов антигеном, приготовленным из эритроцитов барана, с последующим взятием крови и отделением сыворотки, причем перед проведением иммунизации кроликов обрабатывают 3-4-кратно цитотоксической сывороткой с интервалом 3-4 дня, а иммунизацию осуществляют путем комбинирования подкожного и внутривенного введения антигена, приготовленного из эритроцитов барана. Способ осуществляется следующим образом. А. Техника получения цитотоксической сыворотки. У свежезабитых здоровых кроликов извлекают красный костный мозг, селезенку, лимфатические узлы. Ткани промывают в стерильном физиологическом растворе, измельчают на гомогенизаторе в течение 15 минут при 3000 об/мин, подвергают 3 кратному замораживанию-оттаиванию и смешивают в соотношении 111. Полученную смесь суспендируют в изотоническом растворе натрия хлорида (0,9) в соотношении 15 и помешивают в течение 24 часов при температуре 2-4 С. Полученную взвесь фильтруют через 3 слоя марли, консервируют 0,5 фенола и добавляют к 1 части суспензии 2 части геля гидроокиси алюминия. Полученный антиген используют для подкожной иммунизации ослов. Для получения цитотоксической сыворотки отбирают клинически здоровых ослов, полученных из благополучных по инфекционным болезням хозяйств. Иммунизацию осуществляют подкожным введением антигена в предлопаточную область или область средней трети шеи. Иммунизацию проводят 5-7-кратно с интервалом 7-10 дней в нарастающих дозах 5, 10, 15, 20, 25, 30 мл. На 6-8 день после последней иммунизации испытывают активность сыворотки путем ее титрации в реакции диффузной преципитации в агаровом геле. При достижении титра не менее чем 18 у ослов осуществляют производственное взятие крови в объеме 0,5-1 л. Взятую кровь помещают на 30 минут в термостат при 37 С, а затем отделяют сгусток и помещают пробы в холодильник при 4-6 С на 1420 часов, после чего стерильно отсасывают про 2 зрачную сыворотку, инактивируют ее (прогреванием при 50 С) и консервируют 0,5 фенолом. Б. Техника получения антигена. Для получения эритроцитов используются бараны, полученные из благополучных по инфекционным и инвазионным болезням хозяйств, с обязательным исследованием на бруцеллез и инфекционный эпидидимит. Кровь у барана берут из яремной вены стерильной иглой в стерильную колбочку(флакон) со стеклянными (фарфоровыми) бусами или шариками с небольшим количеством изотонического раствора натрия хлорида (0,9 ). Кровь осторожно встряхивают круговыми движениями, фибрин оседает на шариках, кровь становится дефибринированной. Жидкую часть сливают в центрифужные пробирки, центрифугируют, жидкость над осадком отсасывают, осадок ресуспендируют изотоническим раствором натрия хлорида, вновь центрифугируют и надосадочную жидкость отсасывают. Такое отмывание эритроцитов повторяют несколько раз, пока жидкость над осадком эритроцитов не станет прозрачной и бесцветной. Осадок эритроцитов эмульгируют в стерильном изотоническом растворе натрия хлорида, чтобы 1 мл эмульсии содержал 1 см 3 эритроцитов. Этой эмульсией иммунизируются кролики. В. Техника иммунизации животных. Для получения гемолизина отбирают клинически здоровых кроликов, полученных из благополучных по инфекционным болезням кролиководческих ферм. Использовались кролики породы шиншилла массой 1,5-2 кг. Для исследования были взяты две группы кроликов по 10 голов в каждой. Опытной группе за 7-10 дней до начала иммунизации трехкратно, с интервалом 3 дня, вводили путем подкожной инъекции цитотоксическую сыворотку в дозе 0,001 мл на 1 кг живой массы. Для удобства дозировки перед использованием сыворотку разводили стерильным изотоническим раствором натрия хлорида 1100. Иммунизацию 20 кроликов осуществляли подкожными и внутривенными инъекциями. Внутривенное - в ушные вены, подкожное - в подушечки лапок всех четырех конечностей. К антигену, вводимому подкожно, добавляли гель гидроокиси алюминия в соотношении 20-50 , или вводили антиген, состоящий из 1,5 частей ланолина, 1 части вазелинового масла, 1,5 частей физиологического раствора и 2 частей эмульсии эритроцитов. В первый день иммунизации такая смесь вводилась подкожно в подушечки лапок по 0,2 мл в каждую и одновременно антиген эритроцитов - внутривенно в дозе 0,5 мл (общая доза антигена 0,9 мл). Иммунизацию осуществляли 4-6-кратно с интервалом 4-6 дней по схеме в подушечки лапок по 0,2 мл внутривенно 1 инъекция - 0,3-0,5 мл, 2 инъекция - 0,5-0,7 мл, 3 инъекция - 0,7-1,0 мл, 4 инъекция - 1,0-1,5 мл, 5 инъекция - 1,5-2,0 мл. На 6-8 день после последней иммунизации испытывают активность сыворотки путем ее титрации в гемолитической системе. Для этого взятую кровь помещают на 30 минут в термостат при 37 С, а за 14296 тем отделяют сгусток и помещают пробы в холодильник при 4-6 С на 14-20 часов, после чего стерильно отсасывают прозрачную сыворотку, инактивируют ее (прогреванием при 50 С), консервируют глицерином 11 или 0,5 фенолом. Одновременно в качестве контроля использовались 10 кроликов, иммунизированных по общепринятой методике отмытыми эритроцитами барана. Кроликам 4-5 раз внутривенно вводили 40-50 взвесь отмытых эритроцитов с 2-3-дневным интер валом. Через неделю после последней инъекции у кроликов брали кровь, отсасывали сыворотку, инактивировали и титровали в гемолитической системе. Г. Титрация гемолитической сыворотки (гемолизина). Титром гемолитической сыворотки считается то наибольшее разведение ее, которое растворяет эритроциты барана в присутствии комплемента. Схема тирации гемолизина приведена в таблице. Таблица Изотонический раствор натрия хлорида, мл 11000 1111 11250 11429 11666 12000 12500 13333 15000 110000 Контроль гемолитической сыворотки Контроль комплемента Контроль эритроцитов Все пробирки встряхивают и помещают в водяную баню при 37-38 С на 10-15 мин. Учет результатов титрации начинают с пробирок с наибольшим содержанием гемолизина (наименьшим разведением), в пробирке с наименьшим количеством гамолизина, где произойдет гемолиз (лизис эритроцитов),жидкость станет красной и прозрачной, это количество принимают за предельный титр. В результате учета результатов титрации гемолизина было установлено, что средний титр гемолизина был выше у кроликов опытной группы и составил в среднем 12200, тогда как у кроликов контрольной группы в среднем составил 11500. Кроме того, у кроликов, иммунизированных с предварительной обработкой цитотоксической сывороткой, практически не отмечалось осложнений после иммунизации,тогда как у контрольных кроликов часто возникали осложнения после иммунизации. В дальнейшем использование данной методики в производстве по зволило получать высокоактивную гемолитическую сыворотку - гемолизин, что подтверждено при работе с более чем 74 животными. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения гемолизина для реакции связывания комплемента, включающий иммунизацию кроликов антигеном, приготовленным из эритроцитов барана, с последующим взятием крови и отделением сыворотки, отличающийся тем, что перед проведением иммунизации кроликов обрабатывают 3-4-кратно цитотоксической сывороткой с интервалом 3-4 дня, а иммунизацию осуществляют путем комбинирования подкожного и внутривенного введения антигена, приготовленного из эритроцитов барана.