Способ получения комплемента для реакции связывания комплемента

КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕМЕНТА ДЛЯ РЕАКЦИИ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА(57) Изобретение относится к иммунологии и серологии, в частности к производству комплемента,используемого в качестве компонента при постановке реакции связывания комплемента. Способ получения комплемента для реакции связывания комплемента включает взятие крови у морских свинок, отделение сыворотки с последующим ее титрованием, причем за 7-10 дней перед взятием крови морским свинкам вводят цитотоксическую сыворотку в дозе 0,001-0,005 мл на кг живой массы. Предложенный способ позволяет получить сыворотку морских свинок с высоким содержанием комплемента.(72) Ахметсадыков Нурлан Нуролдинович Хусаинов Дамир Микдатович Амиргазиев Ералы Куанышбаевич Иванов Николай Петрович(56) Практикум по ветеринарной микробиологии. М. Агропромиздат, 1989, с.126 Биологические и химиотерапевтические ветеринарные препараты. М Издательство сельскохозяйственной литературы,журналов и плакатов, 1963, с.343686732 А 14178 Изобретение относится к иммунологии и серологии, в частности к производству комплемента,используемого в качестве компонента при постановке реакции связывания комплемента. Известен способ получения комплемента путем взятия крови у морских свинок, отделением сыворотки и получением комплемента (Практикум по ветеринарной микробиологии. М. Агропромиздат,1989, с. 126). Недостатком способа является то, что комплемент, содержащийся в сыворотке крови, является показателем реактивности организма, и его количество в сыворотке крови, зависящее от реактивности,не всегда высокое, что снижает эффективность способа. Задачей изобретения является разработка способа получения комплемента для реакции связывания комплемента, позволяющего получить сыворотку с высоким содержанием комплемента. Способ получения комплемента для реакции связывания комплемента включает взятие крови у морских свинок, отделение сыворотки с последующим ее титрованием, причем за 7-10 дней перед взятием крови морским свинкам вводят цитотоксическую сыворотку в дозе 0,001-0,005 мл на кг живой массы. Пример получения комплемента. А. Техника получения цитотоксической сыворотки. У свежезабитых здоровых морских свинок извлекают красный костный мозг, селезенку, лимфатические узлы. Ткани промывают в стерильном физиологическом растворе, измельчают на гомогенизаторе в течение 15 минут при 3000 об, подвергают 3-кратному замораживанию-оттаиванию и смешивают в соотношении 111. Полученную смесь суспендируют в изотоническом растворе натрия хлорида (0,9 ) в соотношении 15 и выдерживают при помешивании в течение 24 часов при температуре 2-4 С. Полученную взвесь фильтруют через 3 слойную марлю, добавляют антибиотики (по 10000 ЕД пенициллина и стрептомицина на 1 мл) и центрифугируют при 3000 об в течение 15 минут. Надосадочную жидкость используют для внутривенной иммунизации кроликов. Осадок ресуспендируют, добавляя к 1 части 2 части изотонического раствора натрия хлорида и 2 части геля гидроокиси алюминия. Полученную суспензию используют для подкожной иммунизации кроликов. Для получения цитотоксической сыворотки отбирают клинически здоровых кроликов, полученных из благополучных по инфекционным болезням кролиководческих ферм. Использовались кролики породы шиншилла массой 1,5-2 кг. Иммунизацию кроликов осуществляют подкожными и внутривенными инъекциями. Внутривенное- в ушные вены, подкожное - в подушечки лапок всех четырех конечностей. В первый день иммунизации доза антигена вводилась подкожно в поду 2 шечки лапок по 0,2 мл в каждую и одновременно внутривенно в дозе 0,5 мл (общая доза антигена 0,9 мл). Иммунизацию осуществляли 4-6-кратно с интервалом 4-6 дней по схеме в подушечки лапок по 0,2 мл внутривенно - 1 инъекция 0,3-0,5 мл, 2 инъекция 0,5-0,7 мл, 3 инъекция 0,7-1,0 мл, 4 инъекция 1,0-1,5 мл, 5 инъекция 1,5-2,0 мл. На 6-8 день после последней иммунизации испытывают активность сыворотки путем ее титрации в реакции диффузной преципитации в агаровом геле. При достижении титра не менее чем 18 кроликов обескровливают. Взятую кровь помещают на 30 минут в термостат при 37 С, а затем отделяют сгусток и помещают пробы в холодильник при 4-6 С на 14-20 часов, после чего стерильно отсасывают прозрачную сыворотку, инактивируют ее (прогреванием при 50 С), консервируют 0,5 фенолом. В. Техника получения комплемента. В качестве доноров использовались морские свинки массой 350-800 г. Кровопускание объемом 4-14 мл проводилось из сердца в зависимости от массы донора. Средний объем кровопускания составляет 8 мл. Выход комплемента составляет 50-52. Для исследования были взяты две группы морских свинок по 25 голов в каждой. Опытной группе за 7-10 дней до кровопускания вводили путем подкожной инъекции цитотоксическую сыворотку в дозе 0,001 мл на 1 кг живой массы. Для удобства дозировки перед использованием сыворотку разводили стерильным изотоническим раствором натрия хлорида 1100. Взятие крови, отделение сыворотки и получение комплемента проводили по общепринятой методике. При титрации комплемента использовали свежеполученную сыворотку морских свинок. Комплемент (сыворотку морской свинки) разводят 110 (1 мл сыворотки 9 мл физиологического раствора) и разливают в пробирки в различных объемах. Затем объем каждой пробирки доводят до 1,5 мл физиологическим раствором (вместо недостающих компонентов - сыворотки и антигена). Штатив с пробирками помещают в термостат на 45 минут, после чего во все пробирки с разведением комплемента прибавляют по 1 мл гемолитической системы (смесь гемолитической сыворотки и эритроцитов барана, выдержанную в термостате (30 минут). Через 45 минут учитывают результат. Пробирки 11 и 12 при данном титровании служат контролем, указывающим на то, что комплемент без гемолитической сыворотки (пробирка 11) и гемолитическая система без комплемента (пробирка 12) гемолиза не вызывают. Титром комплемента называется минимальное его количество, в присутствии которого происходит полный гемолиз эритроцитов под воздействием гемолитической сыворотки. Схема титрации приведена в таблице. 14178 Таблица Схема титрации комплемента В результате учета результатов титрации комплемента морских свинок было установлено, что средний титр комплемента был выше у животных опытной группы и составил в среднем 0,12, тогда как у животных контрольной группы в среднем составил 0,25. При производственном испытании было получено несколько серий активного комплемента, соответствующего стандарту титра, при недостаточном титре у животных контрольной группы. При этом,согласно регламенту, серию сыворотки сливают в бутыль, куда добавляется 524 (химически чистый), 4 борной кислоты, тщательно перемешивают, бутыль помещают в холодильную камеру и выдерживают в ней в течение 20 ч при 2-4 С. Полученный комплемент разливают по 1 мл в стерильные ампулы из нейтрального стекла емкостью 6 мл, и каждую ампулу закрывают стерильной ватной пробкой. После этого производят лиофильное высушивание, запайку ампул и прочие операции известным способом. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения комплемента для реакции связывания комплемента, включающий взятие крови у морских свинок, отделение сыворотки с последующим ее титрованием, отличающийся тем, что за 7-10 дней перед взятием крови морским свинкам вводят цитотоксическую сыворотку в дозе 0,0010,005 мл на кг живой массы.