Способ получения белка с активностью GM-CSF приматов

(51)61221/02,1215/27 НАЦИОНАЛЬНОЕ ПАТЕНТНОЕ ВЕДОМСТВО РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА С АКТИВНОСТЬЮ - ПРИМАТОВ(57) Способ получения и изолирования вектора трансформации, содержащего ФСК/кДНК, описан. Способ заключается в приготовлении РНК из клеток, которые продуцируют ФСК приготовлении полиаденилированной матричной РНК из указанной РНК приготовлении однониточной кДНК из указанной матричной РНК превращении однониточной кДНК в двуниточную кДНК, вставке двуниточной кДНК в векторы трансформации и трансформировании бактерий указанным вектором для образования колоний, пересадке пулов из 200-500 колоний каждый и изолирования плазмиды ДНК из каждого пула трансфекции плазмиды ДНК в подходящие клетки-хозяева для экспрессии ФСК-белка, культивировании трансфецированных клеток и проверке надосадочного слоя на ФСК активность и отборе ФСК положительных пулов и скринировании колоний,использованных для создания пула, для идентификации колонии, обладающей ФСК активностью. Также описана кДНК, кодирующая белок, обладающий ФСК активностью(а именно ФСК/кДНК), микроорганизм или клеточная линия,трансформированные рекомбинантным вектором,содержащим такую ФСК/кДНК, и способ получения ФСК белка путем экспрессии указанной ФСК/кДНК при культивировании микроорганизма или клеточной линии. Изобретение также обеспечивает способ очистки ФСК-белков и полученные таким образом очищенные белки. 8562 Настоящее изобретение относится к получению Человеческая ФСК активность была получена белка, обладающего способностью стимулировать из плаценты некоторых плодных тканей, макророст и дифференциацию первичных кроветворных фагов и стимулированных Т-клеток. Линия Т-клеток прогениторных клеток, в частности, фактора стиму- (Мо), которая продуцирует одну или несколько ляции колонии (ФСК). В одном аспекте изобретение мощных ФСК активностей, была установлена от обеспечивает способ получения ФСК-белка путем пациента с вариантом Т-клетки волосатой клетки технологии рекомбинантной ДНК, векторы, содер- лейкемии (лейкемический ретикулоэндотелиозис) жащие ген экспрессии указанного белка, микроорга- (, 1978, , 52, 1068-1072). Способность ФСК активноти стимулировать низмы и клеточные линии, трансформированные указанными векторами, и ФСК-белок, полученный продуцирование гранулоцитов и макрофагов укатаким образом. Второй аспект изобретения обеспе- зывает, что фармацевтические композиции, облачивает способ выделения и очистки ФСК-белка из дающие ФСК активностью, являются клинически природных или рекомбинантных источников и очи- полезными в ситуациях, когда требуется повыщенный таким образом ФСК-белок, имеющий сте- шенное продуцирование таких типов (миелоидных) пень чистоты и уровень активности выше тех, что клеток. Действительно, показано, что некоторые пациенты с крайне высокими уровнями, по-видибыли описаны ранее. мому, нормальных циркулирующих гранулоцитов Предпосылки изобретения Найдено, что многие различные типы клеток имеют опухоли, которые сверх-продуцируют ФСК. крови происходят из многопотенциальных крове- В одном случае при хирургическом удалении опухотворящих клеток спинного мозга. Клетки спинного ли количество гранулоцитов быстро падает к нормозга выполняют две функции они репродуцируют мальному уровню, четко подтверждая, что ФСК мосами себя, в результате чего поддерживается попу- жет быть полезным при регулировании количеств ляция клеток спинного мозга в организме, и они циркулирующих гранулоцитов. (, . обеспечивают потомство клеток, передающее разли- , ., и , Д., , 61, 600 (1983. В чия в любых типах зрелых клеток крови. Клетка, частности, ФСК композиции являются клинически которая передает различия по конкретному крове- полезными для лечения миело-супрессии, вызванной творному пути, называется клеткой-предшест- хемотерапевтическим лечением рака или его лечевенником. Клетки-предшественники для Т-лимфо- нием с помощью облучения. Кроме того, ФСК комцитов, В-лимфоцитов, гранулоцитов, красных кро- позиции являются полезными при лечении сильных вяных клеток, тромбоцитов и эозинофилов, так же, инфекций, потому что ФСК может увеличивать как и более ранние предшественники, которые могут и/или активировать количество гранулоцитов и/или индивидуально приводить к увеличению некоторых моноцитов. Имеются различные дифференцированные титипов зрелых клеток, были экспериментально изучены как, так и(Дех, Т. М., 1883, пы известных ФСК активностей, включая грану 141, 415-433). Уже было определенолоциты. ФСК (-ФСК), макрофаг-ФСК (М-ФСК) что пролиферация и/или дифференциация гранулоцит-макрофаг ФСК (М-ФСК) и мультипредшественника каждого типа клеток зависит от ФСК. определенных факторов, которые происходили из Настоящее изобретение, в частности, относится различных источников. Например, последние пред- к -ФСК. ФСК-белки являются известными из шественники красных кровяных клеток требуют раз-личных животных источников. Однако настояфактора, называемого эритропоиэтином. Факторы, щее изобретение, в частности, относится к приматтребующиеся для выживания, пролиферации и диф- ному ФСК, более конкретно - к человеческому ФСК ференциации миелоидных предшественников, пере- и к обезьяннему ФСК. ходящих в форму зрелых нейтрофильных гранулоБиологическая и биохимическая характеристика цитов, моноцитов и зрелых макрофагов, называют композиций, обладающих ФСК активностью, и изуфакторами стимуляции колоний (ФСК). чение этих композиций в клинических условиях быФСК активность экстенсивно изучалась на мы- ло затруднено до настоящего времени недостаточшах. Большинство органов взрослых мышей проду- ным количеством и примесями ФСК-композиций цирует ФСК активность. Однако композиции, со- человека и/или других приматов. Следует учитыдержащие ФСК активность, которые были получены вать, что должно быть желательным идентифицироиз различных тканей и различными методами, раз- вать белок или белки, ответственные за ФСК активличаются по своим биохимическим характеристи- ность. Кроме того, желательно иметь приматный, в кам. Так, структурное соотношение между различ- частности, человеческий источник такого ФСК, коными факторами остается неизвестным. Кроме того, торый может легко снабжать такими белками в таФСК активность действует на более чем одной ста- ких количествах и такой чистоты, которые достадии развития гранулоцита и макрофага, и снова точ- точны для биологической и биохимической характено не известно, единственный ли фактор является ристики и для использования их в качестве терапевответственным за все наблюдаемые активности или тических агентов. же различные факторы действуют на каждой стадии. Разработанные ранее методики молекулярного( , . и , Д. 198056, 947-957). клонирования делают возможным клонирование 2 8562 нуклеотидной последовательности, которая кодирует ФСК описаны в примере 2 ниже. Во втором аспекте белок, и получение такого белка в достаточном ко- разработан способ очистки, который пригоден для личестве, используя подходящую систему хозяин- выделения и очистки белка ФСК как из рекомбивектор, (Т.Маниати Молекулярное клонирование - нантных, так и природных источников при уровне Лабораторное руководство, Колд Спринг Харбор, очистки и активности намного более высоком, чем Н. И. 1982 г.). Затем белок может быть извлечен по был ранее возможен. известным методикам выделения и очистки. Методы Краткое содержание способа с рекомбинантной ДНК согласно изобретению клонирования, используемые до настоящего времеВ его первом аспекте настоящее изобретение ни, могут быть сгруппированы в три основные категории способы, основанные на знании структуры решает проблемы известного уровня техники и белка, например, его аминокислотной последова- обеспечивает источник белка, обладающего ФСК тельности способы, основанные на идентификации активностью, при использовании технологии с ребелка, экспрессированного клонированным геном, с комбинантной ДНК. В соответствии с настоящим использованием специфического к такому белку ан- изобретением используется новая методика клонититела и способы, основанные на идентификации рования, которая требует только пробу для ФСК видов РНК, которые могут быть транслированы для активности, чтобы клонировать кДНК, кодирующую получения белка или активности, кодируемых инте- белок, обладающий ФСК активностью. Итак, настоящее изобретение обеспечивает кДНК, кодируюресующим геном. Каждый из этих классов способов становится щую белок, обладающий ФСК активностью (т.е. трудным для применения, когда интересующий бе- ФСК/кДНК), микроорганизм или клеточную линию,лок, такой, как ФСК-белок, доступен в очень малом трансформированную рекомбинантным вектором,количестве. Следовательно, если трудно получить содержащим такой ФСК/кДНК, и способ получения адекватное количество очищенного белка, то трудно ФСК белка путем экспрессии указанной ФСК/кДНК и определить аминокислотную последовательность при культивировании микроорганизма или клеточили даже частичные последовательности белка. По- ной линии. Поскольку ФСК белок продуцируется из добным образом идентификацию экспрессированно- клона в соответствии с настоящим изобретением, мы го белка связывающим антителом предпочтительно можем быть уверены, что это белок, который облапроводят при использовании поликлональной анти- дает ФСК активностью. Далее изобретение заклюсыворотки с высоким титром. Такая антисыворотка чается в способе получения и изоляции вектора не может быть получена при отсутствии достаточ- трансформации, содержащего ФСК/кДНК, указанных количеств чистого белка (антигена). Монокло- ный способ состоит из- получения РНК из клетки, продуцирующей нальное антитело предполагает альтернативную попытку, но требуемое антитело также может быть ФСК- получения полиаденилированной матричной получено с большим трудом при отсутствии подходящего антигена, и такое моноклональное антитело Р из указанной РНК- получения однониточной кДНК из указанной не может взаимодействовать с белком в том виде, в каком белок экспрессирован доступной рекомби- матричной РНК- превращения однониточной кДНК в двунинантной системой хозяин-вектор. Наконец, трансляция видов РНК для получения идентифицируемого точную кДНК- вставки двуниточной кДНК в векторы трансбелка или активности требует, чтобы искомая РНК находилась в источнике РНК в достаточном избыт- формации и трансформирование бактерий указанке, чтобы получить достоверный белок или сигналь- ным вектором для образования колоний- отбора пулов из 200-500 колоний каждый и ную активность. Относительный избыток РНК, кодирующей конкретный белок, обычно параллелен изоляции плазмиды ДНК из каждого пула- трансфекции плазмиды ДНК в подходящую избытку белка, так что редкий белок обычно кодируклетку-хозяина для экспрессии ФСК белка ется редкой РНК.- культивирования трансфецированных клеток и Моноклеточную линию использовали как в качестве исходного материала для очистки человече- испытания надосадочного слоя на ФСК активность- отбора ФСК положительных пулов и скриниских ФСК, так и для идентификации соответствующих матричных РНК. Однако даже при таком отно- рования колоний, использованных для образования сительно хорошем источнике ФСК активности ока- пула, чтобы идентифицировать колонии, обладаюзалось очень трудно выделить белок даже для струк- щие ФСК активностью. ФСК-белки настоящего изобретения обеспечитурных исследований. Для того, чтобы решить проблемы, присущие вают рост и дифференциацию гормонов для клеток клонированию нуклеотидной последовательности, миелоидной системы. Например, указывалось на их кодирующей редкий белок, такой, как ФСК, с по- клиническое использование при лечении миелосумощью описанных выше способов, разработан но- прессии, особенно (симптоматической) гранулоцивый способ. Этот способ требует только, чтобы ген- топении после хемотерапевтического лечения рака ный продукт или его активность могли быть досто- или после его лечения облучением. верно измерены. Подходящие способы определения 3 8562 Краткое описание чертежей ществлено несколькими хорошо известными ферНа фиг. 1 представлены последовательности ментативными методами, включая связывание тупоДНК, которые кодируют ФСК-белок в соответствии го конца Т 4 лигазой. с настоящим изобретением. Последовательность Ориентация относится к порядку нуклеотидов в ДНК, представленная полностью, кодирует один последовательности ДНК. Обратная ориентация повариант человеческого ФСК, упоминаемый как следовательности ДНК представляет собой последоФСК-Т. Другой аллель кодирует идентичный про- вательность, у которой порядок последовательности дукт с тем исключением, что Т в положении 100 5 к 3 по отношению к другой последовательности заменен е (ФСК-). Изменения, показанные выше является обратным при сравнении указанного места для человеческой последовательности, представляют в ДНК, из которой последовательность была полусобой различия в последовательности ДНК, коди- чена. Такие указанные точки (места) могут включать рующей ФСК гиббона (ФСК обезьяны гиббона) направление транскрипции других определенных(ФСК-). Также показаны уменьшенные последова- последовательностей ДНК в источнике ДНК или в тельности аминокислот. источнике репликации реплицируемых векторов,Н фиг. 2 схематически представлено получе- содержащих последовательность. ние плазмиды рТР из плазмидыД 26 рА (3). Трансформация означает изменение генотипа На фиг. 3 схематически представлено продол- клеток путем клеточного поглощения экзогенной жение рис. 2 и иллюстрируется получение плазмиды ДНК. Трансформация может быть детектирована в некоторых случаях путем изменения фенотипа клет 91023 из плазмиды рТР . Н фиг. 4 схематически представлено продол- ки. Трансформированные клетки называются трансформантами. Пре-транформация клеток указываетжение рис. 3 и показана плазмида р 91023 (В). На фиг. 6 схематически представлен вектор ся в отношении родительских клеток. Трансляция означает синтез полипептида из-185. На фиг. 7 схематически представлен вектор матричной РНК. Активность фактора стимуляции колоний(ФСК) может происходить из ряда клеточных исДетальное описание способа Следующие определения приведены для облег- точников, включая кондиционированную среду из чения понимания настоящей заявки. По мере того, периферических моноядерных клеток крови, ткани как определения меняются в зависимости от значе- легких и плаценты, и костного мозга, мочи от анений, применяемых на данном уровне техники, при- мичных пациентов, сыворотки и нормальных и неопластичных клеток Т-лимфоцита и моноядерного веденные ниже определения даны для контроля. Амплификация означает процесс, при котором фагоцита. Одна клеточная линия, которая продуциклетки продуцируют копии генов внутри их хромо- рует ФСК, представляет собой Мо клеточную линию, депонированную и доступную публике из сомальной ДНК. ФСК представляет собой биологическую актив- АТСС под кодовым номером СР 8066. ФСК, продуность, определенную путем анализа, описанного цированный этой клеточной линией, известен как гранулоцитный макрофаг ФСК (или -ФСК) и,здесь. ФСК белок представляет собой белок из при- разумеется, как человеческий ФСК. Одним источниматного источника, который проявляет ФСК актив- ком ФСК гиббона является линия Т-клеток, обознаность. Для целей настоящего изобретения термин ченных ИСД М -144 и депонированных и доступФСК-белок включает модифицированный ФСК- ных для публики из АТСС под кодовым номером белок, аллальные вариации ФСК-белка и ФСК- НВ 9370, депонированы 29 сентября 1983 г. Для того, чтобы изолировать ФСК клон в соотбелок, предшествующий МЕТ-остатку. Направление вниз означает направление к 3- ветствии с настоящим изобретением, была использована новая процедура, которая требует только техконцу нуклеотидной последовательности. Усилитель представляет собой нуклеотидную ники определения ФСК-активности. Сначала иденпоследовательность, которая может сделать возмож- тифицируют клетку, которая продуцирует ФСК акной транскрипцию гена независимо от положения тивность, такую, как Т-лимфоцитные клетки (или усилителя по отношению к гену или от ориентации другие источники, такие, как представлены выше). Затем собирают мРНК клетки. Предпочтительно последовательности. Ген представляет собой дезоксирибонуклеотид- используют Т-лиффоцитные клетки. В таком случае ную последовательность, кодирующую данный бе- отделяют связанную с мембраной мРНК, которая лок. Для целей настоящей заявки ген не должен содержит мРНК для лимфокина, от свободной мРНК включать нетранслируемые боковые области, такие, в клетках. Это отделение, как полагают, обогащает как сигналы начала транскрипции Н, сайты поли- собранную мРНК в 5-10 раз последовательностями аденильного присоединения, промоторы и усилите- для лимфокина и таким образом сокращает усилия,вкладываемые в идентификацию целевого ФСК ли. Связывание представляет собой процесс обра- клона. Затем получают полиаденилированную матзования фосфоди/сложно/эфирной связи между 5- и ричную РНК хроматографией на олиго- Т-целлю 3-концами двух нитей ДНК. Оно может быть осу- лозе. 4 8562 Готовят банк кДНК из мРНК, используя вектор, ся способность активировать или делать возможной подходящий для трансфекции в хозяина для экс- транскрипцию независимо от положения или ориенпрессии целевого белка, обладающего ФСК актив- тации. Промоторы должны быть расположены вверх ностью. Сначала получают нить кДНК с использо- от гена, тогда как усилители могут находиться вверх ванием стандартных методик, применяя полученную или 5 от промотора, внутри гена как интрона, или выше мРНК. Затем превращают гибрид РНК/кДНК вниз от гена между геном и сайтом полиаденилиров двуниточную форму кДНК. Затем кДНК может вания. Вставленные промоторы не являются функбыть вставлена в подходящий вектор. циональными, а вставленные усилители являются. Предпочтительная система хозяин-вектор для Усилители являются цис-активными, а именно они изоляции клона ФСК основана на экспрессии ФСК действуют на промоторы, только если они находятся кДНК в подходящем векторе трансформации. Под- в одной и той же нити ДНК. Общую дискуссию об ходящий вектор трансформации может обеспечить усилителях смотри у., , 33, 313-314 случайное введение ДНК в клетки млекопитающих. (1983). Предпочтительные усилители для использова( , Р., . Ра, У.Т. , 1981,Се, 27, 279-288). Для изоляции целевых ФСК- ния в клетках млекопитающих получают из вирусов трансформантов не требуется, чтобы все клетки по- животных, таких, как обезьяний вирус 40, вирус пуляции стабильно содержали экзогенные гены, ко- полиомы, вирус бычьей папилломы, ретровирус и торые экспрессируют целевой ФСК-продукт. Воз- аденовирус. Идеально усилитель должен быть из можно временное вхождение экзогенных генов в вируса, для которого клетка-хозяин является рекосубпопуляцию клеток, так что субпопуляция будет мендованной, т.е. который обычно заражает клетки экспрессировать целевой продукт в течение несколь- хозяина. Вирусные усилители могут быть легко поких дней. Поскольку нет нужды в отбираемом мар- лучены из публично доступных вирусов. Усиликере в векторе трансформации для трансфекции вающие области для некоторых вирусов, а именно ДНК и системы экспрессии в соответствии с на- вируса саркомы Рауса и обезьяньего вируса 40, хостоящим изобретением, экзогенная ДНК может быть рошо известны. Смотри.,33, 705-716 потеряна при росте клеток в течение 1-2 недель. Од- (1983). Из традиционной молекулярной биологии нако через 2-3 дня после трансфекции подходящих известно расположение этих областей на основе клеток млекопитающих, как было обнаружено, це- опубликованных карт рестрикции для указанных левые продукты могут быть синтезированы и могут вирусов и, в случае необходимости, можно модифицировать сайты, чтобы сделать возможным сращибыть детектированы. Выбор системы хозяин-вектор основан на раз- вание усилителя с вектором, как желательно. Навитии клеточных линий С/-1 обезьян, трансформи- пример, смотри Кауфман и др., . . ., 159,рованных молекулой ДНК репликация-проис- 601 - 621 (1982) и Мо. Се В. 2 (11), 1304-1319 хождение-дефектных 40 (, У., , 23, (1982). Альтернативно усилитель может быть синте 175-182, 1981). Трансформированные -1 клетки зирован из данных последовательностей размеры обезьян, содержащие дефектную 40 ДНК, обо- вирусных усилителей (обычно менее примерно 150 значенные(С-1, дефектное происхождение, пар оснований) являются достаточно маленькими, 40), не содержат полной копии генома 40, но чтобы это могло быть осуществлено на практике. продуцируют высокие уровни широкого Т антигена Другим элементом, который должен присутсти разрешают репликацию ДНК 40. Они также эф- вовать в векторе, является сайт полиаденилированфективно поддерживают репликацию 40, содер- ного сращивания (или присоединения). Он преджащих делеции в ранней области, и бактериальных ставляет собой последовательность ДНК, располоплазмид, которые содержат 40 источник репликации женную вниз от транслируемых областей гена, вско(Муе, . . , . 1980, РА 77, 6491- ре вниз от которого в свою очередь добавляются 6495). Следовательно, такая система обеспечивает рибонуклеотиды остановки транскрипции и аденина средство амплификации трансфецированной экзо- для образования полиаденинового нуклеотидного генной ДНК через репликацию ДНК медиированных хвоста на 3 конце матричной РНК. Полиаденилиро/40, чтобы повысить уровень мРНК и белка, экс- вание является важным при стабилизации матричпрессированного из экзогенной ДНК. Однако также ной РНК против разложения в клетке, ситуация, при являются полезными другие подобные системы. которой снижается уровень матричной РНК и, слеВекторы, использованные для ФСК экспрессии, довательно, уровень белкового продукта. обычно содержат различные элементы, такие, как Эукариотные сайты полиаденилирования хороусилители, промоторы, интроны, сайты полиадени- шо известны.последовательность сущестлирования, 3 некодирующие области и активаторы вует среди эукариотных генов гексануклеотид 5 трансляции, как будет описано ниже. АА(ААА-3 найден 11-30 нуклеотидов от точки, в Здесь векторы могут включать усилители. Уси- которой начинается полиаденилирование. Последолители функционально отличаются от промоторов, вательности ДНК, содержащие сайты полиаденилино очевидно работают совместно с промоторами. Их рования, могут быть получены из вирусов в соответфункция на клеточном уровне еще недостаточно по- ствии с опубликованными сообщениями. Типичные нятна, но их уникальной характерной чертой являет- последовательности полиаденилирования могут 5 8562 быть получены из бета-глобина мыши и поздней или содержит соединенную форму трехчастного лидера ранней областей генов обезьяньего вируса 40, но и гены А аденовируса. предпочтительными являются вирусные сайты поЭти векторы могут быть синтезированы по мелиаденилирования. Поскольку эти последовательно- тодикам, хорошо известным специалистам в данной сти являются известными, они могут быть синтези- области. Компоненты векторов, такие, как усилитерованыи связаны в вектор традиционным ли, промоторы и т.п., могут быть получены из приспособом. родных источников или синтезированы,как описано Последовательность, которая отделяет сайт по- выше. В основном, если найдено, что компоненты в лиаденилирования от трансляционного стоп-кодона, ДНК доступны в большом количестве, а именно,является предпочтительно нетранслируемой после- такие компоненты, как вирусные функции, или если довательностью ДНК, такой, как непромотирован- они могут быть синтезированы, например, сайты ный эукариотический ген. Поскольку такие последо- полиаденилировання, тогда при соответствующем вательности и гены не обеспечены промотором, они использовании рестрикционных ферментов могут не будут экспрессироваться. Последовательность быть получены большие количества вектора при должна простираться на значительное расстояние, простом культивировании организма-источника,порядка примерно 1000 оснований, от стоп-кодона переваривании его ДНК соответствующей эндонукдо сайта полиаденилирования. Такая 3-нетранс- леазой, отделении фрагментов ДНК, идентификации лируемая последовательность обычно в результате ДН, содержащей интересующий элемент, и его приводит к повышению выхода продукта. Вектор извлечении. Обычно вектор трансформации должен может заканчиваться примерно за 30 пар оснований быть введен в малом количестве и затем связан в вниз отпоследовательности полиаденили- подходящий автономно реплицирующийся синтетирования, но предпочтительно сохранить 3-пос- ческий вектор, такой, как прокариотная плазмида ледовательности, найденные вниз по ходу от сайта или фаг. В большинстве случаев может быть исполиаденилирования, в окружении их дикого типа. пользована плазмида рВР 322. Смотри Кауфман и Эти последовательности обычно протягиваются др., выше. примерно на 200-600 пар оснований вниз от сайта Синтетический вектор используют для клониполиаденилирования. рования связанных векторов трансформации обычНаличие нитронов в нетранелируемом транс- ным образом, а именно путем трансфекции возможкрибируемом участке вектора может увеличить вы- ного прокариотного организма, репликации синтеход продукта. Такие интроны могут быть получены тического вектора с большим числом копий и извлеиз других источников, чем клетки хозяина или ис- чения синтетического вектора при лизисе клеток и точники генов. Например, гибридный интрон, со- отделения синтетического вектора от клеточного стоящий из 5 сайта сращивания от второго интрона дебриса. трехчастного лидера аденовируса и 3 сайта сращиВекторы, содержащие кДНК, приготовленную вания от гена иммуноглобулина, вставленного вниз из клетки, которая продуцирует ФСК активность,от сайта старта транскрипции в основной последний затем трансфецируют в Е. и помещают на чашки промотор аденовируса, приводит в результате к уве- Петри приблизительно 2000 колоний на чашку. Колонии вынимают на нитроцеллюлозный фильтр и личению выхода продукта. В предпочтительном варианте вектора клониро- фильтр переносят на новую пластину, которую хравания ФСК и экспрессии имеется ген активатора нят как первый оригинал. После выращивания этих трансляции. Активаторы трансляции являются ге- колоний делают реплики и сравнивают с оригинанами, которые кодируют или белок, или продукты лом, тщательно отмечая, чтобы секции фильтров РНК, которые влияют на трансляцию целевой реплик могли быть идентифицированы с соответстмРНК. Лучшим примером вляется аденовирус- вующим участком пластины оригинала. Каждый фильтр реплику разрезают на секции,ассоциированныйген (1), который считывается в коротких типах РНК, которые взаимодейст- содержащие заранее определенное число колоний на вуют с последовательностями в 5 нетранслируемой секцию, предпочтительно 200-500 колоний на секобласти основных поздних мРНК аденовируса цию. Колонии с каждой секции соскабливают в сре( . ., 1982, Се, 3, 543). Необходимые ду, такую, как -бульон, бактерии собирают ценпоследовательности трансляционной активации с трифугированием и отделяют плазмиду ДНК. ПлазпомощьюРНК лежат внутри трехчастного лиде- миду ДНК каждой секции трансфецирут в подходяра последней РНК аденовируса. Трехчастный лидер щего хозяина для экспрессии белка. Предпочтительаденовируса сращивается вместе с несоприкасаю- ный синтетический вектор здесь является мутантом щимися областями генома аденовируса и находится Е.со плазмиды рВР 322, в которой были делецирона 5-конце основных последних транскриптов аде- ваны последовательности, которые являются вредновируса. ными для эукариотных клеток. Смотри Кауфман и/А РНК может взаимодействовать для актива- др., выше. Использование этого мутанта устраняет ции трансляции мРНК, которые содержат последо- необходимость в делении остатка плазмиды перед вательность трехчастного лидера. Итак, предпочти- траксфекцией. После выращивания трансфециротельный вектор клонирования кДНК и экспрессии ванных клеток среды проверяют на ФСК актив 6 8562 ность. Положительная проба показывает, что коло- остатка номер 100 (начиная от А после стрелки) и ния, содержащая ФСК/кДНК, находится на конкрет- может быть упомянута как ФСК (Т). Другая ваной секции на фильтре. риация имеетостаток у положения 100 и может Для определения, какой из клонов на секции быть упомянута как ФСК . Очищенный ФСКисходного первого оригинала фильтра содержит белок настоящего изобретения проявляет удельную ФСК/кДНК, каждый клон на секции фильтра пере- активность, по крайней мере, 107 единиц/мг белка и саживают и выращивают. Затем культуры помеща- предпочтительно, по крайней мере, 4,107 единиц/мг ют на матрицу. Пулы получают от каждого горизон- при пробе с человеческими клетками костного мозтального ряда и вертикальной колонки матрицы. га. Системы вектор-хозяин для экспрессии ФСК Готовят образцы ДНК из каждого пула культуры и трансфецируют в клетку-хозяина для экспрессии. могут быть прокариотическими или эукариотичеНадосадочные слои для .каждого пула проверяют на скими, но сложность ФСК может сделать предпочФСК активность. Одна вертикальная колонка пула и тительной систему экспрессии млекопитающих. горизонтальный ряд пула должны продуцировать Экспрессия легко осуществляется при трансформаФСК активность. Клон, общий для этих пулов, будет ции прокариотических или эукариотических клеток содержать ФСК/кДНК. Если матрица содержит подходящим вектором ФСК. Последовательность больше одного положительного клона, больше чем ДНК, полученная по описанной выше процедуре,одна колонка и ряд должны быть положительными. может быть экспрессирована непосредственно в В таком случае может быть необходимым дальней- клетках млекопитающих под контролем подходящего промотора. Гетерологические промоторы, хорошо ший скрининг малого количества клонов. Вырезают ФСК/кДНК из клонов рестрикцион- известные специалистам в данной области, могут ными ферментами, и можно провести определение быть использованы. Для экспрессии ФСК в прокааминокислотной последовательности обычными ме- риотических или дрожжевых клетках должна быть тодами. Можно легко оценить, что описанная здесь удалена лидерная последовательность (или секрепроцедура может быть использована для получения торная последовательность). Положение кодона для ФСК/кДНК из любого источника. Полная последо- -терминала зрелого ФСК белка показано на фиг. 1. вательность ФСК/кДНК в соответствии с изобрете- Это может быть сделано с использованием станнием представлена на фиг. 1 вместе с предсказанной дартных методик, известных специалистам в данной аминокислотной последовательностью транслиро- области. Как только получают целевой ФСК/кДНК клон, используют известные и подходящие средства ванного ФСК белка. Последовательность ДНК, кодирующая белок, для экспрессии ФСК белка, а именно вставку в подпроявляющий ФСК активность, в соответствии с ходящий вектор и трансфекцию вектора в подходянастоящим изобретением, такая, как представлена щую клетку-хозяин, отбор трансформированных на фиг. 1, может быть модифицирована с помощью клеток и культивирование этих трансформантов для традиционных методик для получения вариантов в экспрессии ФСК активности. Подходящими клеткаконечном ФСК белке, который еще обладает ФСК ми-хозяевами являются бактерии, например, Е.со,активностью в описанных здесь ниже пробах. Так, дрожжи, клетки млекопитающих, например, СНО, и например, одна, две, три, четыре или пять амино- насекомых. Полученный таким образом ФСК белок кислот могут быть заменены другими аминокисло- может иметь метиониновую группу у -терминала тами. В бельгийском патенте 8 98016, приведен- белка (здесь называемого-ФСК). Зрелый белок,ном здесь в качестве уровня техники, описана одна полученный из прокариотических или эукариотичетакая типичная методика для замены цистеина, на- ских клеток, иначе, должен быть идентичным по аминокислотной последовательности, но эукариотипример, серином. В соответствии с настоящим изобретением ческий продукт может быть гликозилированным в ФСБ/кДНК включает природный ФСК/кДНК ген, той же самой степени или в другой, чем природный предшествующий С кодону, и ФСК/кДНК, коди- продукт. Различные методы получения ФСК-белка в рующей аллельные вариации ФСК-белка. Один ал- соответствии с соглашением показаны в приведенлель представлен на фиг. 1. Другой аллель, который ных ниже примерах. Другие способы или материамы обнаружили, имеет тимидиновый остаток в по- лы, например, векторы, будут легко оценены спеложении 365 вместо цитозинового остатка, показан- циалистами в данной области на основе примеров и ного на фиг.1. ФСК-белок настоящего изобретения последующего описания. ФСК-белок, экспрессированный в соответствключает 1-метиониновое производное ФСК-белка(М -ФСК) и аллельные вариации ФСК-белка. Зре- вующих прокариотных или эукариотных клетках,лый ФСК-белок, представленный последовательно- может быть извлечен с помощью методик очистки и стью на фиг. 1, начинается с последовательности разделения, известных специалистам в данной об. ., начало которой обозначено ласти. Однако, как указано, настоящее изобретение стрелкой после нуклеотида номер 59 на фиг. 1. Ме- также обеспечивает способ очистки, пригодный для ФСК- будет начинаться с последовательности ФСК белка как из рекомбинантного, так и природ .Аллельная вариация, пред- ного источников, с помощью которого ФСК-белок ставленная на фиг. 1, имеету аминокислотного 7 8562 может быть получен с высокой степенью чистоты и ны последовательно для получения более высокой активности. чистоты. Краткое описание заявленного способа очистки Фракции от каждой колонки собирают и провеНастоящее изобретение разрешает проблемы ряют на ФСК активность. Активные фракции объеизвестного уровня техники и обеспечивает способ диняют и разбавляют трифторуксусной кислотой очистки белка, обладающего ФСК-активностью. (ТФУК), гептафтормасляной кислотой (ГФМК) или ФСК-белок в соответствии с настоящим изобретени- т.п. и наносят на колонку с С 4 обратимой фазой. ем обладает удельной активностью, по крайней ме- ФСК активность затем элюируют, используя 0-90 ре, 1,107 единиц/мг белка, предпочтительно, по ный ацетонитрильный градиент в ТФУК или ГФМК,крайней мере, 2,107 единиц/мг белка и более пред- предпочтительно при концентрации от 0,10 или почтительно, по крайней мере, примерно 4,107 еди- 0,15(объем/объем), соответственно, в зависимониц/мг белка при пробе с человеческим костным сти от того, какая кислота была использована при мозгом. нанесении объединенных фракций на колонку. В соответствии с настоящим изобретением споФракции, имеющие ФСК активность, анализисоб очистки ФСК-белка состоит из осаждения белка руют СДС-электрофорезом на полиакриламидном сульфатом аммония при 80 -ном насыщении для геле (13,5 гель, как описано Лэммли,227,образования шарика, содержащего ФСК-белок по- 6810 (1970. Дополнительные обработки с испольвторного суспендирования шарика в буферном рас- зованием указанных выше материалов для хроматотворе при рН в интервале от примерно 6 до пример- графических колонок могут дополнительно очистить но 8 нанесения буферного раствора, содержащего ФСК белок для гомогенности. Очищенный ФСК белок, фракционированный ФСК, на хроматографическую колонку, элюирования буферным раствором, содержащим хлористый на СДС-ПАГЭ, показывает гетерогенный ФСК бенатрий, и сбора фракций, обладающих ФСК актив- лок, имеющий кажущуюся молекулярную массу в ностью объединения активных фракций, нанесения интервале от примерно 15 000 до примерно 26 000 их на колонку с С 4 обратимой фазой и элюирования дальтон. Такой кажущийся размер гетерогенности 0-90 -ным градиентом ацетонитрила для сбора имеется благодаря экстенсивному гликозилированию белка и представляет собой обычную характеактивной фракции. ристику гликопротеинов. Фракционирование менее Краткое описание рисунков, относящихся к процессу очистки очищенных образцов из Мо клеток кондиционироРис. 5 иллюстрирует СДС-ПАГЭ анализ очи- ванной среды с помощью СДС-ПАГЭ (в невосстащенного ФСК белка. новительных условиях) и проверка белка, элюироДетальное описание способа очистки ванного из геля, показывает наличие второго белка,по изобретению обладающего ФСК активностью, имеющего кажуФСК-белок, очищаемый в соответствии со спо- щуюся молекулярную массу от примерно 28 000 до собом изобретения, может происходить из любого 30 000. природного источника, описанного выше в качестве ФСК активность связывается и элюируется из исходного источника для рекомбинантного способа октилсефарозы, ДЕАЕ ультрогеля и колонки с С 4 ДНК, например, Мо клеточной линии или СД обратимой фазы. Примерно 60 ФСК активности М-144 гиббоновой клеточной линии. связывается Кон-А сефарозой (40 протекает чеАльтернативно ФСК-белок может быть получен рез) и может быть элюировано альфаметилманнозис использованием методик рекомбинантной ДНК дом. изобретения. Молекулярно-массовый анализ рекомбинантноФСК из любого источника может быть очищен го ФСК гельфильтрацией при низком содержании по способу настоящего изобретения. Кондициониро- соли показывает, что примерно 30 активности ванную среду из любого источника ФСК белка элюируется с определенной молекулярной массой предпочтительно концентрируют ультрафильтраци- около 19 000, но 70 материала находится в качеей до концентрации белка, по крайней мере, около стве димера, элюируется в положении, соответст 0,1 мг белка/мл. Затем белок осаждают при добав- вующем молекулярной массе примерно 38 000. Если лении сульфата аммония до 80 насыщения. Полу- 1 м хлористого натрия включают в эту колонку, вся ченный шарик повторно суспендируют в водном активность элюируется в виде широкого пика прирастворе, забуферированном при рН в интервале от мерно при 19000. примерно 6 до примерно 8. Примерами подходящих Очищенный ФСК является стабильным в течебуферов являются Трис-, НЕР, цитрат натрия ние, по крайней мере, 16 часов при инкубировании и т.п. при 4 С (рН 7,4) в 4 М гуанидин гидрохлориде в Буферный раствор фракционируют хромато- 10 мМ ЭДТА 10 мМ 2-меркаптоэтанола и в 30 графией на колонке. Подходящими материалами для ном (объем/объем) этаноле. ФСК активность также использования при колоночной хроматографии яв- является стабильной в 0,1 -ный трифторуксусной ляются октилсефароза, ДЕАЕ-ультрогель, АсА 44- кислоте (ТФУК) (р 2,0) и 0,1 ТФУК плюс 25 ультрогель, АсА-54 ультрогель и т.п. Один или не- (объем/объем) ацетонитрила. сколько из этих материалов могут быть использова 8 8562 Как указывалось ранее, ФСК белок в соответстМ клетки (АТСС 8066) выращивают травии с настоящим изобретением используется при диционным образом на Альфа (6 СО 2) среде или лечении миелосупрессии, такой, как (симпто- на среде Искова (10 СО 2), содержащей 20 сыматическая) гранулоципения, например, вызываемая воротки зародыша теленка (З), 2 мМ глютамина,химиотерапевтическим лечением рака или его лече- 100 /мл стрептомицина и 100 мкг/мл пенициллина. нием при облучении. В дополнение к атому, ФСК Клетки должны быть субкультивированы каждые 4 белки изобретения, как указывалось, используются 5 дней. Клетки подсчитывают и высевают в колбы при лечении серьезной инфекции. Для такой цели фалькона -175 в 100-50 мл среды при плотности обычно показана дозировка примерно 200- 3-4,105 клеток/мл. Клетки должны удваиваться в 20 1000 мкг/пациента. ФСК-белок предпочтительноСЗТ каждые 4-7 дней. Скорость роста не является вводят пациенту внутривенно с подходящим фарма- постоянной, и клетки могут иногда казаться останокологическим носителем. Примерами таких носите- вившимися в росте, затем проходят через вспышки лей являются фармакологический физиологический роста, Мо клетки могут быть выращены на среде, не раствор и человеческий сывороточный альбумин в содержащей сыворотки. Выживание намного лучше,когда клетки не промывают при переносе из З на физиологическом растворе. Кроме того, ФСК белки изобретения обладают среду, не содержащую сыворотки. Оптимальная другими активностями и применениями. Например, плотность на среде, не содержащей сыворотки было показано, что мышиные ФСК активируют ней- (СНС), составляет 5,105 клеток/мл. Клетки будут трофилы. Следовательно, следует ожидать, что при- расти медленно (или, по крайней мере, сохранять матные ФСК настоящего изобретения также будут постоянное число) в течение 3 дней в среде, не соактивировать нейтрофилы. Поэтому физиологиче- держащей сыворотки, а затем должны быть подпиские функции ФСК могут быть разнообразными. В таны 20 -ной СЗТ в течение, по крайней мере,костном мозге этот лимфокин может стимулировать 4 дней. Рост по такому графику (3 дня СНС, 4 дня пролиферацию и дифференциацию эффекторных 20 СЗТ) может быть повторен еженедельно, если клеток для защиты хозяина, тогда как в периферии требуется СНС среда, без какого-либо ущерба для могут быть активированы новые и существующие клеток в течение нескольких месяцев. Стадия 2. Проба на ФСК активность клетки. В локализованном иммунологическом ответе. Проба с костным мозгом ФСК может сохранять циркулирующие нейтрофилы Получают свободный костный мозг. Отделяют внутри или вне площадей воспаления. Несоответствующая локализация и/или активация нейтрофилов спикулы вытягиванием через иглу 20, 22, а затем 25 может быть включена в патофизиологию различных калибра. Разбавляют 11 стерильным забуферироиммуно-медиированных болезней, таких, как ревма- ванным фосфатом физиологическим раствором(ФБР) (комнатная температура) и наслаивают Фитоидный артрит. Изобретение будет более понятно при ссылке на колл-Пак (примерно 30 мл ВМ-ФБР на 6 мл Фиколследующие иллюстративные варианты, которые яв- ла). Перемешивают при 1500 об/мин в течение ляются чисто примерными и не должны рассматри- 30 минут при комнатной температуре. Удаляют жир ваться как ограничивающие область настоящего и ФБР слой и отбрасывают. Отбирают пипеткой слой малой плотности. Промывают 2 раза ФБР и изобретения, описанную в формуле изобретения. В примерах, если нет других указаний, темпе- считают. Располагают клетки на пластине в(получен от ГИБКО как 1640) плюс 10 ратура дана в градусах Цельсия. Рестрикционные эндонуклеазы используются в(инактивированная теплом СЗТ) в течение 3 таких условиях и по методике, рекомендуемой их часов для удаления приклеившихся клеток. Среда для пластины (готовится свежая) коммерческими поставщиками. Реакции связывания 20 СЗТ проводят, как описано Маниатисом и др., выше, на 0,3 агара, растворенного в воде, охлажденностр. 245-6, описание которых приведено здесь в качестве уровня техники, используется буферный рас- го до 40 2 х Искова (11 объем/объем с агаром) твор, описанный на стр. 246, и концентрация ДНК 11 Р/ конечная концентрация 100 /мл 100 мкг/мл при температуре 23 С для ДНК с тупыми концами и 16 С для ДНК с липкими концами. стрептомицина, 100 мкг/мл пенициллина 10-4 М альфа-тиоглицерина в 2 х Искова из Проводят электрофорез в 0,5-1,5 -ных агалозных-2 гелях, содержащих 90 мМ Трис-бората, 10 мМ ЭД- 10 М исходного Агар, охлажденный до 40. Смесь ТА. Всю радиомеченную ДНК метят 32 р, какая бы с другими ингредиентами. Охлаждение на водяной бане до 37-38 и храметодика метки не использовалась. Быстрый преп означает быстрое, маломас- нение при этой температуре. Через 3 часа отбирают пипеткой неприклеивштабное продуцирование бактериофага или плазмиды ДНК, например, как описано Маниатисом и др., шиеся клетки. Перемешивают и подсчитывают. Добавляют 2,105 клеток/мл посевной среды и хранят выше, стр. 365-373. при контролируемой температуре водяной бани 37 Пример А Стадия 1. Культивирование Мо клеточной ли- 38 . Прибавляют образцы (например, среды от нии трансфецированных клеток, обычно 10 мкл образца) 9 8562 в первый рад углублений пластины микротитратора происходящий из гена иммуноглобулина, находится в двойной повторности. Прибавляют 100 мкл сус- между 2 основным последним промотором и попензии клеток в каждое углубление. Прибавляют следовательностью, кодирующей ДГФР. 40 рандополнительные 50 мкл суспензии клеток в каждое ний сайт полиаденилирования находится вниз от углубление в первом ряду. Тщательно смешивают и последовательности, кодирующей ДГФР. Секция переносят 50 мкл раствора из первого ряда в сле- прокариотного происхождения 26(3) взята дующий ряд и т.д. и продолжают разбавления 13 из( .,., .поперек пластины. Обертывают пластину пара-Т., 1981, С 27 279-288) и не содержит фильмом. Инкубируют 10-14 дней при 10 СО 2, рВР 322 последовательностей, известных для инги 37 С в полностью влажной атмосфере и подсчиты- бирования репликации в клетках млекопитающих вают колонии.( .., 1981,Для подсчета колонии считают общее число ко- 293 79-81).Д 26(3) превращают в плазмиду лоний, которое выросло в каждом углублении. В каждой пробе несколько углублений засевают без рС 2, как показано на рис. 2. рАоД 26 рА(3) включения образца (холостой) для получения осно- превращают в плазмиду рАоД 26 А(3) путем делевы для отсчета колоний. Среднее число колоний, ции одного или двух Р сайтов в рАоД 26 рА(3). которые выросли в контрольных углублениях, вычи- Это осуществляется при частичном переваривании тают из числа колоний, найденных в каждом углуб- Р(используя недостаточность ферментной активлении, содержащем образцы. Одна единица СЗТ ности, чтобы таким образом могла быть получена представляет собой количество, которое будет сти- субпопуляция линеаризированных плазмид, в котомулировать образование одной колонии больше кон- рых отщеплен только один Р сайт), затем проводят трольного уровня на 105 клеток человеческого кост- обработку по Клейноу, связывание для рециркуляриного мозга (засеивается 10 клеток/мл), когда кон- зации плазмиды, трансформацию Е.и скриницентрация СЗТ является суб-насыщенной. Суб- рование для делеции Рсайта, локализованного у 3 насыщенная концентрация определяется разбавле- 40 последовательности полиаденилирования. Трехчастный лидер аденовируса и гены ассонием и сравнением числа колоний при различных разбавлениях для нахождения концентрации чуть циированных вирусов (А гены) вставляют в рАД 26 рА(3) , как показано на рис. 2. Сначала ниже уровня насыщения. Для этой пробы подсчитывают колонии, содер- рАоД 26 (3)расщепляют , чтобы сдежащие гранулоциты, моноциты или оба типа клеток. лать линейную молекулу открытой внутри 3 участка Типы клеток в колониях определяются отбором ко- первого из трех элементов, составляющих трехчастный лидер. Затем 43 (. 1979, Се , 16,лоний и окрашиванием индивидуальных клеток. 851) переваривают Хо , обрабатывают по КлейВ. Проба с - клетками- клетки (, 56,3 (1980 выращивают ноу, переваривают Ри изолируют фрагмент 140 в среде Искова 10 СЗТ, переносят 2 раза в неде- пар оснований, содержащий второй и часть третьего лю и высевают каждый пассаж 2,105 клеток/мл. лидеров, с помощью электрофореза на полиакрилаКлетки используют для пробы только между пасса- мидном геле (6 в Трис-боратном буфере Маниажем 30-35. Проба является такой же, как описанная тис и др. (1982) выше). Фрагмент 140 пар основавыше для костного мозга, с тем исключением, что ний затем связывают с Р переваренной- клетки высевают в агаровую смесь при Д 26(3) . 4,103 клеток/мл. Продукт связывания используют для трансфорЧисло колоний, выросших в каждом углубле- мации Е. для резистентности к тетрациклину и нии, определяют и вычитают контрольный счет хо- скринируют колонии, используя процедуру Грюнлостого опыта, как и в описанном выше опыте с ко- щтейна-Хогнесса с примерением 32 Р-меченного зонстным мозгом. Одна К-1 СЗТ единица/мл означает да гибридизации для фрагмента 140 пар оснований. такую концентрацию СЗТ, которая будет стимули- Получают ДНК из положительно гибридизованных ровать половину максимального числа (насыщение) колоний, чтобы проверить, находится ли реконстК-1 колоний для роста. Максимальное число полу- руированныйсайт в 5 или в 3 концах вставчают при включении уровня насыщения СЗТ в не- ленной определенной ДНК 140 пар оснований во 2-м или 3-м лидерах последних аденовируса. При праскольких углублениях. вильной ориентациисайт находится на 5 стоСтадия 3. Конструирование вектора 91023(В) Вектор трансформации представляет собойроне вставки 140 пар оснований. Эту плазмиду обоД 26(3), описанную Кауфманом и др., ., значаютна фиг. 2.. 2 (11) 1304-1319 (1982). Он имеет струкД фрагмент 40, содержащий 40 туру, представленную на рис. 2. Короче, эта плазми- усиливающую последовательность, получают при да содержит мышиный ген кДНК дигидрофолат ре- переваривании 40 ДНК ферментом , затупдуктазы (ДГФР), который является основным по- лении концов фрагментом Клейноу Ро , связываследним промотором аденовируса 2 (А 2) при нии Хлинзоров с фрагментами, переваривании транскрипционном контроле. 5 сайт сращивания одля открытия о 1 йт и изоляции четвервключен в ДНК аденовируса, а 3 сайт сращивания, того мог большого (Д) фрагмента гельэлектрофо 10 8562 резом. Затем этот фрагмент связывают с разрезанМо клетки индуцируют в течение 16-20 часов с ной Хо 1 рТР, получая плазмиду рС 2-ТР. помощью А идля усиления продуцирования Ориентация 40 Д фрагмента в 2- бу- ими лимфокина. Эти клетки высевают при 5,105 дет такой, что 40 последний промотор находится клеток/мл в среду Искова с 20 -ным СЗТ, 0,3 в той же ориентации, как основной последний про- (объем/объем) Р и 5 нг/мл ТРА. Клетки собимотор аденовируса. рают центрифугированием. Шарик клеток снова Для введения генов ассоциированного вируса суспендируют в 20 мл охлажденного на льду гипо(А) аденовируса в 2- сначала конст- тонического буфера ( буфер 0,01 М и-,руируют плазмиду рВР 322, которая содержит фраг- рН 7,4, 0,01 М , 0,0015 М 2, 1 мк/мл цикломент аденовируса типа 2 В. ДНК аденовиру- гоксимида, 50 единиц/мл Р-син и 5 мМ дитиоса тип 2 переваривают Ни изолируют фраг- тройнола). Клеткам дают набухнуть на льду в течемент В после гельэлектрофореза. Затем этот фраг- ние 5 минут, затем механически разрывают 10 удамент вставляют в рВ 322, которую заранее перева- рами плотной гарнитуры стеклянного гомогенизаторили. После трансформации Е. со для ре- ра. Гомогенат центрифугируют при низкой скорости зистенции к ампициллину скринируют рекомбинаты (2000 об/мин в центрифуге Бегман 6) для удаления для вставки фрагментаи определяют ори- ядер и нелизированных клеток. Надосадочный слой ентацию вставки при переваривании рестракцион- хранят на льду до тех пор, пока шарик из ядер не ным ферментом. рВ 322 -В содержит суспендируют повторно в 10 мли снова не отфрагментВ аденовируса типа 2 в ориента- центрифугируют с низкой скоростью. Этот второй надосадочный слой объединяют с первым и центриции, представленной на фиг. 3. Как показано на фиг. 3,А гены обычно полу- фугируют объединенные надосадочные слои с низчают из плазмиды 322-В при пере- кой скоростью для удаления остаточного загрязневаривании , добавлении Есо линкоров и пере- ния ядрами и нелизированными клетками. Надосавариваниии извлечении фрагмента 1,4 кв. дочный слой из этой операции доводят до 0,15 М Фрагмент, имеющийлипкие концы, затемдобавлением 2 М , затем центрифугируют с связывают посайту(которая была ранее высокой скоростью (25000 об/мин, Бекманротор переварена ). После трансформации Е.со в течение 30 минут), чтобы получить шарик из мем и отбора на резистентность к тетрациклину бран. Мембранный шарик тщательно промывают колонии скринируют путем гибридизации на фильт- холодным , затем повторно суспендируют в ре с специфическом зондом ДНК для А генов. 12 млВ, содержащем 2 М сахарозы и 0,15 М ДНК получают из положительно гибридизирован- С. Готовят два прерывистых градиента в центриных клонов и характеризуют перевариванием рест- фужных трубках Бекман 41 путем наслаивания 6 рикционными эндонуклеазами. Полученную плаз- мл мембранного раствора в 2 М сахарозы на 2 мл миду обозначают р 91023.с 2,5 М сахарозы и 0,15 М С. Трубки заполУдаляют оба Есо йт в р 91023. р 91023 раз- няют доверху путем наслаивания сверху 2,5 мл РВ,резают полностью , генерируют два фрагмента содержащих 1,3 М сахарозы и 0,15 М . Эти граДНК, один примерно 7 кв, а другой - примерно 1,3 диенты перемешивают в течение 4 часов при кв, содержащиегены. Концы обоих фрагментов 27000 об/мин (Бекман, ротор 41) при 40 . являются заполненными при использовании фраг- Мембранный слой (при границе фаз между 2,0 М и мента Клейноу , а затем оба фрагмента, а имен- 1,3 М сахарозы) тщательно удаляют сбоку, испольно 1,3 кв и 7 кв связывают вместе. Плазмиду зуя иглу 18 калибра и шприц. Объединяют мемр 91023/А/, содержащуюгены, и подобную бранные фракции из двух градиентов и разбавляют р 91023, но делецированную на 2 йт , иден- 1 объемом дистиллированной воды, затем смешитифицируют с помощью скрининга Грюнштейна - вают с 0,5 Тритона -100 и 05 деоксихолата Хогнесса с фрагментомгена и с помощью тра- натрия, затем экстрагируют равным объемом фенола. Водный слой повторно экстрагируют смесью 11 диционного анализа сайтов рестрикции. Затем удаляют единственный сайт Р в р 91023 фенола и хлороформа и, наконец, равным объемом/А/ и заменяют сайтом . р 91023/А/ разрезают хлороформа. Наконец осаждают соединенную с для завершения, а затем обрабатывают фраг- мембранойдобавлением хлористого натрия до ментом Клейноу Родля генерации полных концов. 0,25 М и 2,5 объемов холодного этанола и инкубиЕсо линкеры связывают с затупленнымсай- руют всю ночь при -20 С. Осажденнуюсобитом 91023//. Линейную р 91023/А/ с Есо линке- рают центрифугированием (4000 об/мин в течение рами, присоединенными к тупомусайту, отде- 10 минут в центрифуге Бекман -6) и повторно сусляют от неприсоединенных линкеров и переварива- пендируют в 1 мл дистиллированной воды. Из 2,109 ют для завершения , а затем повторно связы- клеток получают приблизительно 1 мг . Матвают. Извлекают плазмиду р 91023/В/ и идентифи- ричную(мК) изолируют из всейхроцируют, чтобы иметь структуру, подобную матографией на колонке с 0,5 мл олиго-Тр 91023/А/, но ссайтом, расположенным на целлюлозой. Кратко,нагревают в течение 5 минут, быстро охлаждают на льду, затем разбавместе предыдущего Рсайта. ляют в 5 раз при комнатной температуре связываюСтадия 4. Получение кДНК банка 11 8562 щим буфером (0,50,01 М Трис-, рН 7,4, в течение 60 минут при 37 С. Реакцию останавли 0,002 М ЭДТА, и 0,1 СДС). РНК в связывающем вают экстрацией фенолом/хлороформом и собирают буфере переносят на колонку с олиго-Т-цел- метилированную кДНК осаждением этанолом. люлозой, уравновешенную связывающим буфером,Шарик кДНК промывают 70 этанола, затем при комнатной температуре. Колонку промывают повторно суспендируют в 200 мклбуфера (Маниа 5 мл связывающего буфера, затем 5 мкл 0,15 тис и др.) и инкубируют с 200 единицами . 0,01 М Трис-, рН 7,4, 0,002 М ЭДТА и 0,1 нуклеазы при 30 С в течение 30 минут. Реакцию СДС. Наконец, элюируют мК 2 мл 0,01 М Трис- останавливают экстракцией фенолом/хлороформом,7,4, 0,002 М ЭДТА и 0,1 СДС мРНК и собирают кДНК осаждением этанолом. осаждают добавлением хлористого натрия до 0,25 М Двуниточную кДНК притупляют инкубироваи 2,5 объемов этанола и инкубируют всю ночь при - нием в 100 мкл 20 мМ Трис, р 7,4 50 мМ ,20 С. Осажденную мК собирают центрифугиро- 10 мМ 2-меркаптоэтанола и 500 ляных всех ванием (30000 об/мин в течение 30 минут в роторе четырех деоксинуклеотидтрифосфатов с 25 едини 55 Векмана). Трубку тщательно сливают и шарик цами Клейноу при комнатной температуре в течение мРНК повторно суспендируют в 50 мл воды. По- 30 минут. Реакцию останавливают экстракцией февторно суспендированную мРНК доводят до 0,25 М нолом/хлороформом и собирают кДНК осаждениемзатем экстрагируют 1 раз смесью 11 фенола и этанолом. хлороформа затем 3 раза хлороформом. Осаждают Связывают кДНК в 50 млк Т 4 лигазного буфера м добавлением 2,5 объемом этанола. Смесь за- (Маниатис и др.) с 500 рМолейлинкеров, полумораживают и оттаивают несколько раз на бане су- ченных от Нью Инглэнд Биолабс (последохой лед/этанол, затем центрифугируют 15 минут в вательность СС), используя 2000 едицентрифуге Эпнендорфа. Трубку тщательно сливают ниц Т 4 лигазы в течение ночи при 16 С. Реакцию и шарик мК повторно супендируют в 20 мкл останавливают инкулированием при 70 в течение дистиллированной воды. Конечный выход составля- 20 минут, затем разбавляют до 300 мкл так, чтобы ет примерно 30 мкг мК. конечная концентрация соли составляла 0,1 М аС,Готовят первую нить кДНК, используя стан- 10 мМ 2, 50 мМ Трис-,7,4. Затем кДНК дартные методики. Кратко, 10 мкг мембранной переваривают 2 минуты при 37 С 700 единицами мК разбавляют в 100 мкл реакционной смеси Ксо. Реакцию останавливают экстракцией феносинтеза кДНК, содержащей 300 мМ Трис, рн 8,4, лом/хлороформом и собирают кДНК осаждением 140 мМ . 10 мМ 2, 10 мМ - этанолом. Шарик повторно суопендируют в 50 мкл меракаптоэтанола, 500 мМ каждой из ,, ТЕ и пропускают через колонку 5 мл С-4. Выве и , 5 мкг олиго/фосфорилированного денные фракции собирают, объединяют и осаждают и со средним размером 12-18 (в качестве праймера, этанолом. Осажденную кДНК подвергают электро 150 32 Р(400 К/ммоль и 20 единиц инги- форезу через 1 -ный агарозный гель в Трисбитора рибонуклеазы -син. Реакцию иницииру- ацетатном буфере в присутствии 1 мкг/мл этидиют добавлением 100 единиц обратной транскрипта- нийбромида. Изолируют из гелия кДНК с размером зы и инкубируют 30 минут при 42 С. Реакцию ос- в интервале 500-4000 пар оснований, используя танавливают добавлением ЭДТА до 40 мМ и разла- стандартную методику со стеклянным порошком. кДНК экстрагируют феногают К инкубированием в течение 20 минут при Элюированную 65 С в 0,2 М аОН. Основание нейтрализуют до- лом/хлороформом, осаждают этанолом и шарик (побавлением 20 мкл Трис, р 7,4. Реакционную смесь сле промывки этанолом) повторно суспендируют в затем экстрагируют фенолом/хлороформом, снова 60 мкл ТЕ. Конечный выход составляет 100-500 нг экстрагируют 50 мкл 10 мМ Трис,7,5 1 мМ ЭД- кДНК. Получение вектора экспрессии р 91023/В/ опиТАи объединяют водные фазы. Однониточную кДНК превращают в двуниточную инкубированием сано выше. Связывают переваренныйи обрав течение 12 часов при 16 С с 40 единицами фраг- ботанный фосфатазой вектор (500 нг) со 100 нг мента Клейноу ДНК полимеразы 1 в 100 мкл реак- кДНК в 100 мкл реакционной смеси (стандартная Т 4 ционной смеси, содержащей 50 мМ фосфата калия, лигазная реакционная смесь) в течение ночи при рН 7,4, 2,3 м ДТТ, 2-меркаптоэтанол, 10 мМ 16 С. Реакцию останавливают экстракцией феноС 2, 150 Молей каждой из четырех деоксинук 32 лом/хлороформом, затем связанную кДНК собирают леотидтрифосфатов и 25 СТР. Реакцию прекращают экстракцией фенолом/хлороформом и осаждением этанолом после добавления 5 мкг т-РНК удаляют не вошедшие трифосфаты пропусканием в качестве носителя. Осажденную этанолом ДНК промывают 70 водной фазы через колонку с 1 мл сефадексом -50. этанола, затем повторно суспендируют в 100 мкл Выведенные фракции объединяют и осаждают этаТЕ. Эту ДНК используют в 4 мкл аликвотов для нолом. трансформации Е. МС 1061 (4 мкл в 100 мкл Шарик кДНК промывают холодным этанолом,затем повторно суспендируют в 200 мкл 20 мМ трансформационной среды). Каждую из 25 стансТрис, р 8,0, 1 мМ ЭДТА 80 Молярном 5- формаций переносят в 150 мм чашки Петри с 1 аденозил-метионине и 300 единицах Есо метилазы агара, -бульоном и 10 мкг/мл тетрациклина (Те 12 8562 пластины) и инкубируют вою ночь при 37 С. На Стадия 6. Изолирование ФСК клона каждой пластине вырастает приблизительно Каждым из образцов ДНК со стадии 5 отдельно 2000 колоний, в результате получают около стансфецируют М 6 СО клетки обезьяны, как опи 50 000 колоний. После достижения примерно 0,5 мм сано ниже. в диаметре колонии переносят на нитроцеллюлозные М 6 клетки выращивают рутинно в среде Игла,диски (137 мм), осторожно размещая сухой фильтр модифицированной Дальбекко ДМЕ, (доступная из на поверхности пластины, затем мягко отщепляют Джибко), содержащей 10 инактивированной тепфильтр. Все колонии на пластине переносят на лом сыворотки зародыша теленка (Н), раздефильтр, который затем помещают (колонии сбо- ляют дважды в неделю при разбавлении 16. Через ку/ ) на свежую Те-пластину. После выращи- 24 часа после разделения М 6 клетки готовы для вания колоний в течение нескольких часов готовят трансфекции. За 24 часа до трансфекции высевают реплику каждого из фильтров, помещая свежий 1,2.108 М 6 клеток (деление 16) в Клеточный Фактор влажный фильтр точно на первоначальный фильтр, (доступный т Нунк) в 1,5 л ДМЕ 10. прижимая их друг к другу, отщепляя их, затем воз- Непосредственно перед трансфекцией пластины отвращая каждый фильтр на свежую Те-пластину и сасывают и дважды промывают 7 мл не содержащей инкубируя пластины всю ночь при 37 С. Каждую сыворотки ДМЕ. ДНК растворяют в 0,1 М Трис (рН реплику тщательно маркируют, чтобы ее можно бы- 7,3) и прибавляют в ДМЕ среде, содержащей 2 мМ глютамина, 100 мкг/мл трептомицина, 100 /мл ло сравнить о оригинальным фильтром. пенициллина и 0,25 мг/мл ДЕАЕ Декстрана, доводя Стадия 5. Приготовление пула плазмид ДНК Каждый из 25 фильтров-реплик осторожно раз- до 4 мл раствором Трис-ДНК. Прибавляют 4 мл резают на восемь частей, используя скальпель и от- среды, содержащей растворенную ДНК, на пластимечая ориентацию каждой восьмой части относи- ну, содержащую М 6 СО клетки, и инкубируют в тельно оригинального фильтра. Соскабливают коло- течение 12 часов. После инкубации клетки промывают один или нии с каждой секции в 10 мл бульона. Бактерии собирают центрифугированием (30000 об/мин,10 два раза 7 мл . Затем прибавляют 5 мл ДМЕ минут, центрифуга Бекман -6), повторно суспенди-10 Н, 100 /мл пенициллина, 100 мкг/мл руют в 0,6 мл 25 сахарозы. 50 М Трис-, р 8,0 стрептомицина, 2 мМ глютамина и 0,1 мМ хлорокии превращают в протопласты добавлением 0,12 мл 5 на и инкубируют клетки 2,5 часа. Через 2,5 часа промывают один разДМЕ и мг/мл лизоцима и инкубируют на льду в течение 510 минут. Протопласты снова инкубируют при ком- прибавляют 10 мл ДМЕ 10/пластину. натной температуре 10 минут, затем добавляют Через 30 часов отсасывают среду и подают 0,125 мл 0,5 М ЭДТА, затем лизируют при добавле- 4 мл/пластину ДМЕ 10 Н. Собирают уронии 0,12 мл 10 СДС в 50 мМ Трис-, РН 8,0. жай, удаляя кондиционированную среду после 24 Лизат осторожно смешивают, инкубируют при ком- 26 часов дополнительной инкубации. Кондиционированную среду после каждой натной температуре 15 минут, затем осаждают белок и хромосомальную ДНК добавлением 0,3 мл 5 М трансфекции проверяют на ФСК активность, исаС. После инкубирования на льду в течение 15 пользуя - пробу. Для каждого образца, положиминут лизат центрифугуют на центрифуге эппен- тельного на ФСК активность, должен быть идентидорфа в течение 30 минут на холоде. Осторожно фицирован клон на первоначальном основном удаляют надосадочный слой, оставляя внизу вязкий фильтре, ответственный за ФСК активность. Нашарик ДНК/белок и разбавляют, добавляя 2,5 мл пример, для одной трансфекции, положительной на воды. Смесь экстрагируют 1 мл фенола, разделяют ФСК активность, пересаживают ве колонии с секслои центрифугированием (10 К в течение 10 минут ции первоначального основного фильтра,которого в роторе Серволл -34) и удаляют водный слой в происходит образец трансфекции ДНК. Некоторые свежую трубку. Оаждают ДНК добавлением 0,5 мл из этих 320 колоний пересаживают в 3 мл -бульона 5 М аС и 7,5 мл холодного этанола, заморажива- плюс 10 мкг/мл тетрациклина. Культуры выращиют смесь несколько раз на бане сухой лед/этанол. вают в течение ночи. 320 колоний помещают на Осадок собирают центрифугированием (10, 15 ми- матрицу 18 х 18. Готовят пулы из каждого горизоннут в Сорволл -34), повторно суспендируют в 0,3 тального ряда и вертикальной колонки матрицы мл 0,3 М ацетата натрия и снова осаждают (в трубке (всего 36 пулов) примечание последний горизонЭппендорфа) добавлением 1 мл этанола. После 10- тальный ряд имеет только 14 клонов. Готовят образ 15 минут на бане сухой лед-этанол собирают осаж- цы ДНК из каждой объединенной в пул культуры,денную ДНК центрифугированием (5 минут в цен- затем используют для трансфекции СО-клеток. трифуге Эппендорфа) и готовый шарик снова сус- Проверяют надосадочные слои этих транфекций,пендируют в 100 мкл стерильного ТЕ (10 мМ Трис, используя пробу - колонии. Из этой группы рН 8,0, 1 мМ ЭДТА). Из типичной операции полу- трансфекции получают два положительных один - в чают 5-10 мкг плазмиды ДНК. Каждое приготовле- вертикальной колонке, другой - в горизонтальном ние содержит ДНК из 200-500 колоний на первона- ряду. Общая культура этих пулов содержит ФСКчальном фильтре. Всего приготовлено 200 образцов клон. ДНК из 25 фильтров. 13 8562 Изолируют 12 индивидуальных клонов из этой среду. По возможности быстро после сбора конценкультуры и готовят минипрер ДНК из 10 мл культу- трируют образец отработанной среды в 20 раз ультры в -бульоне, как описано выше. Образцы 10 мкг рафильтрацией под давлением, используя камеру ДНК из этих приготовлений перевариваюти Амикон на 2,5 л с УМ 5 мембраной (5000 отреанализируют полученные в результате фрагменты зок). Стадия 8. Очистка рекомбинантного ФСК ДНКпомощью электрофореза на агарозном геле. 200 мл концентрированной отработанной среды Девять из двенадцати клонов имеют общую вставку приблизительно 750 пар оснований, ДНК из четырех (из 4 л исходного материала - стадия 7) доводят до из этих клонов и остальные три клона вводят в М 6 30 насыщения сульфатом аммония при добавлеС клетки, как описано выше. Надосадочные слои нии твердого сульфата аммония и удаляют осажденот этих трансфекций проверяют, используя - ный белок центрифугированием. Надосадочный слой пробу, а также пробу на ФСК с костным мозгом. доводят до 80 насыщения сульфатом аммония Четыре клона, каждый из которых содержит фраг- добавлением более твердого сульфата аммония и мент 750 пар оснований, все направляют экспрес- осажденный белок собирают центрифугированием. сию М 6 СО клеток с высоким уровнем Ф ак- Шарик повторно суспендируют в 5 мл 20 мМ цитративности, как определено в любой пробе, тогда как та натрия, рН 6,1, содержащем 1 аС, Растводругие три клона нет. Следовательно, кодирующая ренный белок наносят на колонку 1,6 х 100 см Ультобласть для ФСК должна быть локализована внутри рогель АсА 54, уравновешенную тем же самым буфером. ФС активность, элюированная с колонки,вставки 750 пар оснований. Последовательность ДНК, кодирующая ФСК, имеет кажущийся молекулярный вес 19 к дальтон была удалена из вектора трансформации в положи- или после примерно 90 мл. Наблюдали, что если тельном клоне путем переваривания Есо и была проводить гель-фильтрациюнизкой ионной силой,определена ее аминокислотная последовательность с ФСК активность элюируют с колонки в двух полоиспользованием стандартных методов дидеоксисек- женияхкажущимися молекулярными массами венсирования после субклонирования фрагментов в примерно 19 к дальтон и 38 к дальтон, подтверждая,М 13 векторы для получения последовательности, что СМ-ФСК может легко образовать димеры. Объпоказанной на фиг. 1. Плазмида, р 91023/В/-ФСК, единяют активные фракции и доводят до 0,15 кторая сначала показала направленную ФСК- ТФУК (добавлением 10 ТФУК) и наносят на коэкспрессию в СО клетках, была обозначена рС-. лонку Видак 4 (0,46 х 25 м), уравновешенную Эта плазмида была депонирована в Коллекции куль- 0,1 ТФА. Колонку проявляют при линейном гратур американского типа в штамме .-МС 1061 диенте 0-90 ацетонитрила (1 мл/мин, всего под номером хранения АТСС 39754 2 июля 1984 340 мл) в 0,1 ТФУК. ФСК-активность элюируется между 39 и 43 ацетонитрила (фракции 16 года. активность элюируется между 39 и 43 ацетоСтадия 7. Экспрессия ФСК-белка М 6 клетки обезьяны, трансформированные нитрила) (фракции 16-20). Анализируют образец 20 вектором р 91023/В/, содержащим ФСК/кДНК, как мкл фракции 19 с помощью электрофореза на СДСвыделено на стадии 6, выращивают, как описано на полиакриламидном геле (13,5 гель, как описано стадии 6, для получения Ф-белка в культураль- Леммли,227, 680 (1970. Наблюдалась одна широкая полоса белка с кажущейся молекулярной ной среде. В именно 1 мг этой ДНК (5) растворяют в 1 массой 18-26 к дальтон. Более широкий размер помл 0,1 М Трис рН 7,3 и прибавляют к 600 мл ДМЕ, лосы для ФСК является общим признаком гликосодержащим 2 мМ глютамина, 100 11/мл стрепто- протеинов и утончается, отражая экстенсивное, но мицина, 100 мкг/мл пенициллина /Р// и 0,25 переменное добавление углевода. Белок из фракции мг/мл ДЕАЕ Декстрана (молекулярная масса 500 19 подвергают разложению на Эдману, используя 000, получено из Фармациа). 600 мл раствора ДНК газофазный микросеквенатор Апплайд Биосистемс. ДЕАЕ Декстрана прибавляют к М 6 СО клеткам в Из приблизительно 20 мкг нанесенного белка полуустановку для культивирования клеток и инкубиру- чают последовательность из первых 16 аминокислот ют при 37 С в течение 12 часов. После инкубирова- . Высокий выход ния клетки промывают один раз 900 млДМЕ, этой единственной белковой последовательности затем инкубируют 2,5 часа с 600 мл ДМЕ, содержа- хорошо подтверждает, что ФСК-белок во фракции щими 0,1 мМ хлорокина, 10, 2 мМ глюта- 19 был очищен до гомогенности. Биопроба показымина и Р/. После отсасывания среды, содержащей вает, что фракция 19 имеет 3,107 единиц на 280) хлорокин, клетки промываютДМЕ и подают единиц поглощения. Поскольку типичные белки в 1500 мл ДМЕ с 10. Через 30 часов клетки водном растворе дают коэффициенты экстинкции в промываютДМЕ, среду заменяют 800 млинтервале от 0,8 до 1,2 280 единиц поглощения на ДМЕ и помещают трансфецированные клетки в ус- миллиграмм белка, удельная активность очищенноловия среды при 37 С на 24 часа. Отработанную го ФСК находится между примерно 1,107 и примеркондиционированную среду отсасывают и заменяют но 4,107 единиц/мг при испытании с использованием другими 800 млДМЕ. Клетки оставляют на 24 пробы с человеческим костным мозгом. часа в этой среде, затем собирают отработанную 14 8562 Пример В ную смесь инкубируют в течение 10 минут при Клонирование ФСК гиббона 68 С, а затем 2 часа при 57 С. Стадия 1. Получение мРНК из Т-клеток гиббона Стадия 5. Трансформация бактерий Образец линии Т-клеток гиббона, обозначенной Выращивают . штамм 1061 в ИСД-МА 144, культивируют в течение нескольких бульоне, охлаждают на льду, собирают центрифугинедель в 1640 (полученной от Гибко) и 20 рованием и обрабатывают 2 для приготовления сыворотки зародыша теленка (СЗТ) до тех пор, пока их для трансформации. Затем инкубируют 5 мкл не будет получено 1,109 клеток всего. Клетки инду- закаленной реакционной смеси кДНК с 200 мкл обцируют для продуцирования высоких уровней ФСК работанных 2 бактерий. Проводят 50 таких путем активации в течение 24 часов в присутствии трансформаций, используя всю закаленную кДНК, и 10 нг/мл 12-0-тетрадеканоилфорбол-13-ацетата наносят на пластины с 1 -ным агаром -бульоном,(ТФА) в 1640 плюс 1 СЗТ. Соби- размером 15 см, содержащие 10 мкг/мл тетрациклирают выращенные клетки центрифугированием на. На каждой пластине вырастает приблизительно(1000 об/мин, 5 минут), промывают один раз фос- 1000 колоний. фатным буферным солевым раствором (ФБР) и сно- Стадия 6. Посев реплик ва собирают центрифугированием. Пересаживают 10 000 колоний из трансформаИз этих клеток готовят связанную с мембраной ции каждую с помощью зубочистки, переносят на полисомальную (МР) мРНК, используя ту же са- свежие пластины (500 на пластину в решетке) и вымую процедуру, что описана в примере А для полу- ращивают всю ночь при 37 С. Затем колонии сничения Р Мо клеток. мают с каждой пластины, прижимая сухой нитроСтадия 2. Реакция однониточной кДНК целлюлозный фильтр плотно к поверхности пластиРазбавляют 6 мгк МВР мРНК (из стадии 1) в ны. Для каждого из этих основных исходных фильт 50 мкл реакционной смеси для синтеза кДНК (смот- ров готовят два фильтра-реплики. Основные исходри пример А - стадия 4) и инициируют реакцию до- ные фильтры хранят при 4 С, а фильтры-реплики бавлением обратной транскриптазы. После 30 минут обрабатывают основанием и сушат, чтобы подготоинкубирования при 42 С реакцию останавливают вить их к гибридизации. добыванием ЭДТА до 50 мМ и разбавляют водой до Стадия 7. Приготовление 32 Р-меченых зондов гиб 100 мкл. Смесь экстрагируют фено- ридизации лом/хлороформом и снова экстрагируют хлорофорИзолируют вставку кДНК из рС-1 переваримом. Отделяют гибриды кДНК/РНК от непрореаги- ванием рестрикционным ферментом Е.со и элекровавших трифосфатов хроматографией на колонке трофорезом на агарозном геле с Три-ацетатом и с Сефарозой С-4 В. Выведенные фракции объеди- этидинийбромидов. Полосу, содержащую фрагмент няют и собирают гибриды осаждением этанолом. кДНК, вырезают из геля и очищают по методике со Конечный выход составляет 570 нг. стеклянным порошком. Стадия 3. Реакция двуниточной кДНК Затем прибавляют 300 нг фрагмента кДНК к 1 Снова суспендируют шарик однониточной мкл 10 х Т 4 ДНК полимеразного буфера (0,33 М кДНК (стадия 2) в 50 мл воды и проводят синтез Трис-ацетата, р 7,9,0,66 М ацетата калия, 0,1 М второй нити в стандартной реакционной смеси с ацетата магния и 10 мМ дитиотрейтола), к 3 единиЕ.со, Полимеразой 1, Е.со лигазой н РНКазой Н. цам Т 4 ДНК полимеразы Нью Ингленд Биолабс и Реакционную смесь инкубируют в течение ночи при разбавляют водой до 10 мкл. После инкубирования 16 С и затем инкулируют 1 час при 37 С. Реакцию 5-10 минут при 37 оС эту смесь объединяют с 1 мкл останавливают добавлением ЭДТА и экстрагируют 10 хТ 4 ДНК полимеразного буфера 1 мкл 2 мМ расфенолом/хлороформом. Отделяют кДНК от непро- твора каждого из СТР, ТТР, , 10 мкл реагировавших трифосфатов хроматографией на 32 (10 ) мкл 3000 К/ммоль и 3 единиколонке с Сефарозой С-4 В, выведенные фракции цами Тг ДНК полимеразы. Реакционную смесь инобъединяют и собирают кДНК осаждением этано- кубируют в течение 20 минут при 37 С. Затем прилом. бавляют 1 мкл 2 мМи реакционную смесь Стадия 4. Получение рекомбинантной кДНК инкубируют еще дополнительные 10 минут при Снова суспендируют шарик кДНК (стадия 3) в 37 С. 75 мкл воды. Гомополимерные С хвосты присоеОтделяют не включенные трифосфаты от мединяют к концам кДНК при добавлении 10 мкл рас- ченной кДНК хроматографией на колонке с Сефатвора кДНК к 25 мкл стандартной реакционной сме- дексом 100. Готовят второй зонд из синтетического си с концевой трансферазой и инкубируют при 30 С олигонуклеотида, имеющего последовательность в течение 5 минут. Реакцию останавливают добавАТС,лением ЭДТА до 40 мМ и тепловой инактивацией которая комплементарна аминоконцу области, кодипри 68 в течение 10 минут. Закаливают 10 нг этой рующей ФСК. Этот олигонуклетид мечен по 32 кДНК с хвостами с 50 нг -хвостовой рВ 322 (по-на его 5 - концеиспользованием реакции лучена от НН) в 10 мкл 10 мМ Трис, рН 7,5,1 полинуклеотидкиназы. мМ ЭДТА и 100 мМ . Закаленную реакцион 15 8562 Стадия 8. Изоляция клонов ФСК кДНК нием колонки связующим буфером. Связанную матВ стандартной процедуре скрининга гибридиза- ричную РНК элюируют 3 мл воды и осаждают доцией гибридизуют некоторые 45 клонов с Т 4 ме- бавлением 0,2 мл 4 Ми 2,5 объемов холодного ченной рС-1 кДНК. Из них приблизительно этанола. Осажденную мРНК собирают центрифуги 20 также гибридизуются с меченным олигонуклео- рованием (30 минут при 25000 об/мин). Конечный тидным зондом. Кодирующую область одного из шарик (приблизительно 100 мгк) повторно суспенних секвенсировали, и данные последовательности дируют в 50 мкл воды. показывают число замещений основания, некоторые Стадия 2. Реакция однониточной кДНК из которых являются результатом в различии амиРазбавляют 20 мкг РВ мРНК в 50 мкл реакнокислот в экспрессированном белке. Эти различия ции синтеза кДНК, содержащей 100 мМ Трис, рН представлены на фиг. 1 выше последовательности 8,4, 140 мМ , 10 мМ 2, 10 мМ 2 ДНК для гена человеческого Ф, клонированного меркаптоэтанола, 400 мкмМ каждого из АТР,в примере А. ТР, СТР и , 5 мкг олиго- (средний разПример С мер 12-18) в качестве праймера, 25 32 Клонирование ФСК из мРНК лимфоцита пери- (400 К/моль) и 20 единиц ингибитора рибонуклеаферического кровотока зы РНК син. Реакцию инициируют добавлением Стадия 1. Получение мРНК из лимфоцитов пе- 60 единиц обратной транскриптазы при 37 С и инриферического кровотока кубируют 30 минут при 42 С. Реакцию останавлиЛимфоциты периферического кровотока были вают добавлением ЭДТА до 40 мМ и экстрагируют получены из четырех побочных продуктов плазма- равным объемом насыщенного водой фенола. Фефореза (получены от Ред Кромм) при фракциониро- нольную фазу снова экстрагируют 50 мкл ТЕ буфевании на градиенте Фиколл-Гипак. Малая плотность ра. Водные фазы объединяют. Отделяют гибриды в 1640 в присутствии 5 сыворотки зароды- кДНК/РНК от непрореагировавших трифосфатов,ша теленка, 0,17 фитогеммаглютинина и 10 нг/мл пропуская объединенные водные фазы через колонфорбал миристат ацетата (А) при плотности 2,106 ку с 5 мл Сефарозы С-4 В (получена от Сигмы),клеток (мл) всего получено 6,109 клеток. Собирают уравновешенную ТЕ. Фракции, которые отводят из клетки центрифугированием (1000 об/мин, 5 минут), колонки, объединяют, доводят до 2500 мМ аС и один раз промывают солевым фосфатным буфером осаждают нуклеиновые кислоты добавлением и снова собирают центрифугированием. Гото- 2,5 объемов холодного этанола. Гибриды собирают вят цитоплазматическую РНК при осторожном ли- центрифугированием в течение 30 минут при зисе, при котором клетки снова суспендируют в 4000 об/м. Конечный шарик (2,5 мкг кДНК) снова 50 мл холодного Тритонового буфера для лизиса суспендируют в 50 мкл воды.(140 мМ аС, 1,5 мМ 2, 10 мМ Трис,8,6, Стадия 3. Реакция двуниточной кДНК 0,5 Тритон Х-100)10 мМ дитиотрейтола (ДТТ) Синтезируют двуниточную кДНК при совмести 50 единиц/мл син (получена от Биотек). Этот ном действии ферментов Е.со ДНК полимеразы 1,лизат делят на 2 равные части и каждую часть на- Е. ДНК лигазы и Е. РНКазы Н. Реакционная слаивают на 10 мл подушки лизиного буфера, со- смесь (50 мкл) содержит 20 мМ Трис, рН 8,0, 4 мМ держащего 20 сахарозы. Удаляют ядра клеток 2, 1,2 мМ ЭДТА, 25 М НАД, 100 кажцентрифугированием на холоде (4 С, 400 об/мин в дого из , ,и , и течение 5 минут). Осторожно удаляют верхний слой 50 К 32 РСТР/30000 К/ммоль/. Проводят реакцию(цитоплазматический экстракт) и прибавляют доде- при добавлении 3 единиц ДНК полимеразы 1,05 цилсульфат натрия (СДС) до конечной концентра- единиц ДНК лигазы и 0,75 единиц РНКазы Н и инции 1 . Этот раствор дважды экстрагируют рав- кубировании при 16 в течение 18 часов, затем 1 час ным объемом фенола (хлороформа смесь 11) и при 37 С, а затем останавливают добавлением ЭДосаждают РНК добавлением 2,5 объемов этанола. ТА до 40 мМ и экстрагируют равным объемом феОсажденную РНК собирают центрифугированием нола. Фенольную фазу снова экстрагируют 50 мкл(15 минут при 4000 об/мин.) и снова супендируют в ТЕ, объединяют водные фазы и отделяют кДНК от 0,01 М Трис, рН 7,5 1 мМ ЭДТА, 0,25 М аС (ТЕ непрореагировавших трифосфатов хроматографией буфер плюс 0,25 М аС) и снова осаждают добав- на колонке с Сефарозой С-4, как описано выше лением 2,5 объемов холодного этанола. Наконец для однониточной кДНК. Основываясь на включенсобирают РНК центрифугированием и снова суспен- ном 32 Р, однониточная кДНК количественно предируют в 5 мл воды. Конечный выход 7,5 мг. вращается в двуниточную форму. Изолируют матричную РНК из всей цитоплаз- Стадия 4. Получение рекомбинантной кДНК матической Р селекцией на олигоцеллюлозе. Прибавляют гомополимерные С хвосты к Нагревают 2,5 мг всей Р до 65 в течение 5 ми- концам кДНК при осторожном нагревании 400 нг нут. Прибавляют аС до 0,5 М и даютостыть кДНК в 50 МКЛ реакционной смеси, содержащей до комнатной температуры. Эту РНК пропускают 1 мМ 2-меркаптоэтанола, 1 мМ а 2 и 9 единиц через колонку 1 мл олиго-Т-цллюлозы, уравно- концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы, при вешенную в ТЕ 0,5 М аС (связующий буфер). 30 С в течение 5 минут. Реакцию прекращают доУдаляют несвязанную РНК экстенсивным промыва- бавлением ЭДТА до 40 мМ и нагревают до 68 С в 16 8562 течение 10 минут. Закаливают 200 нг этой хвостовой и готовят реприки для гибридизации, как описано кДНК с 500 нг -хвостового рАТ 153 (получена от ниже. Амершем) в 100 мкл 10 мМ Трис, р 7,5, 1 мМ ЭД- Стадия 7. Приготовление фильтров для гибридизаТА и 100 мМ . Реакцию закаливания проводят ции Каждый фильтр-реплику (стадия 6) помещают при 57 С в течение 2 часов после 3 минут предвасбоку колонии на фильтровальную бумагу (Ватман рительной инкубации при 68 С. 3 мм), смоченную в 0,5 М аН, 1,5 Мв течеСтадия 5. Трансформация бактерий Продукт реакции закаливания кДНК использу- ние нескольких минут. Фильтры переносят для нейют непосредственно для трансформации Е. трализации на фильтровальную бумагу, смоченную штамм М 1061. Используют свежую колонию бак- в 1 м Трис, рН 7,5 1,5 Мв течение 2 минут, а териальных клеток для инокуляции 50 мл -бульона затем переносят на вторую группу фильтров для и выращивают несколько часов до тех пор, пока оп- нейтрализации в течение 5-10 минут. Наконец тическая плотность при 550 нм не достигнет 0,25. фильтры помещают на фильтры, смоченныеСКлетки замораживают на льду и собирают центри- буфером (0,015 М цитрата натрия, 0,15 М аС, рН фугированием (2000 об/мин в течение 10 минут). 7,4) в течение 5 минут, сушат на воздухе и прогреШарик повторно суспендируют в 10 мл холодного вают в вакууме при 80 С в течение 1-2 часов. 0,1 м 2 и оставляют на льду на 10 минут. Клет- Стадия 8. Изоляция клонов ФК к ДНК Дубликатные фильтры зондируютрадиоакки собирают центрифугированием (2000 об/мин в течение 5 мин) и повторно успендируют в 2,5 мл тивно меченной вставкой рФСК-1 кДНК, приготов 0,1 М 2. Затем 10 мкл реакционной смеси зака- ленной, как описано выше в примере В. Гибридизуливания кДНК инкубируют с 200 мкл обработанных ют в кДНК 20 колоний. Пересаживают 20 из них с СаС 2 бактерий в течение 30 минут на льду, а затем основного фильтра и выращивают всю ночь в 2 минуты при 37 С, затем добавляют 0,8 мл - бульоне для дальнейшего анализа. Рестрикционный фермент переваривает (Р) образцы ДНК (быстрый бульона и наконец инкубируют 30 минут при 37 С. Осуществляют 20 из этих трансформаций, ис- преп) из этих клонов, показывая, что 3 близки к пользуя вю закаленную кДНК. Каждую трансфор- полной длине. Один из них был секвенсирован. Помированную смесь наливают на пластины с 1 - следовательность области, кодирующей Ф, этого ным агаром -бульоном (15 см диаметр), содержа- клона идентична соответствующей последовательнощие 10 мкг/мл тетрациклина. Из 20 трансформаций сти С-1 (а именно имеет Т в положении 365 все 20 таких пластин были залиты и инкубированы (. Пример Д всю ночь при 37 С. В среднем приблизительно 1500 Очистка ФСК из линии Мо клеток бактериальных колоний выросло на каждой пластиИнкубируют отработанную кондиционированне, всего 30 000 клонов. ную МО среду, не содержащую сыворотки (40 л),Стадия 6. Посев реплик Первоначальные колонии, выросшие на каждой при 55 С в течение 30 минут для инактивации пластине, переносят на 137 мм нитроцеллюлозные НТ-11 вируса, ассоциированного с клеточной фильтры прижиманием сухого фильтра к верхушкам линией. Эту среду концентрируют ультрафильтрациколоний и снятием их с пластины. Готовят две иден- ей под давлением, используя Пелликон Газетт с тичных реплики для каждого исходного фильтра по мембраной(1,5 кв.фута), которая имеет отрестандартной методике посева реплик, в которой ка- зок с молекулярной массой 10000. Затем белок конждый оригинальный фильтр осторожно помещают центрируют осаждением сульфатом аммония (80 сбоку колонии на стерильный квадрат фильтроваль- насыщения). Повторно суспендируют конечный шаной бумаги (Ватман ЗММ), оставляя на квадратном рик белка (800 мг) в 100 мл 20 мМ трис/оксиметид/ кусочке стекла. Новый предварительно увлажнен- аминометана гидрохлорида (Трис-), рН 7,4, и ный нитроцеллюлозный фильтр осторожно накла- диализуют против того же самого буфера (3 раза с дывают поверх основного фильтра, покрывают вто- 4 л загрузки каждый раз). Диализованный белок рым стерильным квадратом фильтровальной бумаги наносят на колонку 2,5 х 10 см с ДЕАЕ (диэтиламии полный сэндвич затем зажимают вместе с первым ноэтил) - ультрагелем, уравновешенным в том же и вторым куском стекла. Нумеруют сэндвичевые буфере. Колонку промывают 800 мл 20 мМ Трисфильтры и 3 отверстия малого диаметра пробивают , рН, 7,4, затем элюируют ФСК-активность 800 через них асимметрично, чтобы можно было точно мл 20 мМ Трим-, рН 7,4, содержащего 0,12 М выровнять в будущем. Затем удаляют реплики с ос- . Собирают фракции 10 мл и проверяют на новы и помещают колонии сбоку на новые пластины ФСК. Объединяют активные фракции (3) и конценс -бульоном агаром, содержащие тетрациклин. Не- трируют в 6 раз (до 5 мл) ультрафильтрацией под медленно готовят вторую реплику идентичным об- давлением (мембрана Амикон УМ 5, отрезок с молеразом. Каждый основной фильтр возвращают на кулярной массой 5000). Концентрированный обрапластину и все пластины инкубируют при 37 С в зец из ДЕАЕ колонки наносят на колонку 1,6 х 100 течение нескольких часов до тех пор, пока бактери- см с АсА 44 ультрагелем (акриламид-агарозный альные колонии не достигнут примерно 1 мм в диа- ультрагель, имеющий фракционирование 10-130 к метре. Основные исходные фильтры хранят при 4 С дальтон), уравновешенным 20 мМ -2-окси 17 8562 этилпиперазн 2-этансульфоновой кислотой (НЕ- ды. Клетки центрифугируют при 3000 с в течение РЕ), рН 7,4, 50 мМ аС и 0,01 полиэтиленгли- 10 минут при 40 и суспендируют в 2,5 мл охлажколя (ПЭГ-8000). Ф активность элюируют с ко- денной 20 сахарозы в 50 мМ Трис-, рН 8,0. лонки с кажущейся молекулярной массой 30 к даль- Прибавляют лизоцим (0,5 мл 5 мл/мл раствора в тон. Объединяют активные фракции и доводят до 0,25 М Трис-01, рН 8,0) и смесь выдерживают на 0,15(объем/объем/трифторуксусной кислоты/ льду в течение 5 минут. Прибавляют ЭДТА (1 мл ТФУК) добавлением 10 ТФУК и наносят на ко- 0,025 М ЭДТА, рН 8,0) и выдерживают на льду еще лонку 125 см с Видак С 4 обратной фазой. Колон- 5 минут, затем медленно прибавляют 1,0 мл 0,05 М ку проявляют с линейным градиентом 0-90 ацето- Трис-С, рН 8,0. Инкубируют суспензию в течение нитрила в 0,1 ТФУК (объезд/объем) при 4 мл/мин 15 минут при 37 С до тех пор, пока бактерии не(всего 1000 мл). Ф активность элюируется при- превратятся в протопласты. Затем суспензию медблизительно при 47 объем/объем (ацетонитрила). ленно разбавляют 20 мл предварительно подогретой Объединенные активные фракции доводят до 0,05 среды, содержащей 10 сахарозы и 10 мМ 2.(объем/объем/гептафтормасляной кислоты ГФМК) и выдерживают 15 минут при 37 С. Раствор протопри добавлении половины объема 0,15(объ- пластов (приблизительно 109 мл) прибавляют к ем/объем/ГМФК) и наносят на колонку (0,46 х 25 СНО, ДГФР дефицитным ДИКХ-11 клеткам в пласм) с Видак С 4, уравновешенной 0,15 объ- стине с 6-ю углублениями (приблизительно 1,106 ем/объем/ГФМК. Колонку проявляют с линейным клеток (углубление) при соотношении примерно 1 градиентом 0-90(объем/объем/ацетонитрила в 2.104 протопластов), клетку и протопласты собирают 0,15/объем/объем/ГФМК при 1 мл/мин. (Всего в шарик в клетки при центрифугировании при 340 мл). Ф активность элюируется примерно при 2000 об/мин в течение 8 минут в дисковом роторе 53/объем/объем/ацетонитрила. Было найдено, что вращающегося микротитратора центрифугиактивными являются фракции 37-44 (1 мл каждая). Модель К. После центрифугирования удаляют надоКонцентрируют 0,15 мл фракции 40 в 4 раза (ис- садочный слой отсасыванием. Прибавляют 2 мл распользуя САВАНТ Спид Вак Концентратор) и при- твора полиэтиленгликоля 50 г РЕО - 1450 (Ва бавляют 40 мкл 2 х СДС гель образца буфера (0,125 Со) в 50 мл среды в каждое углубление плаМ Трис-НС,6,8, 4 СДС, 20 глицерина и стины с 6-ю углублениями. Клетки снова центрифу 0,004 бромфенола голубого). Эти образцы кипя- гируют при 2000 об/мин в течение 90 секунд, удатят 2 минуты и наносят на 13,5 СДС гель (Лэмм- ляют раствор полиэтиленгликоля и пластины три ли .227, 680 (1970) (см. рис. 2. Было оп- раза промывают 4 мл среды (углубление). Затем ределено, что фракция 40 имеет 110 000 единиц клетки трипинизируют, суспендируют в 10 мл среФСК костного мозга мл. Это соответствует пример- ды, содержащей 10 сыворотки зародыша теленка,но 3,0.107 единиц на 280 единиц поглощения. По- и центрифугируют в конической трубке при скольку типичные белки имеют коэффициенты 500 об/мин в клинической центрифуге. Шарики клеэктинкции в интервале между 0,8 и 1,2 280 еди- ток из 3 углублений объединяют и высевают в чашниц/мг, очищенный ФСК имеет удельную актив- ку 10 см для культуры ткани. К каждой пластине ность в интервале от примерно 1,107 до примерно добавляют свежую среду, содержащую 100 мкг/мл 4,107 единиц/мг в пробе с костным мозгом. Подвер- канамицина, тимидина, аденоксина, дезоксиаденогают разложению по Эдману 1 мкг образца очищен- зина, пенициллина и стрептомицина и 10 диалиного -ФСК, используя газофазный микросексен- зованной сыворотки зародыша теленка. Канамицин сатор нанесенный биосистем. Была определена по- вводят для предотвращения роста любых бактерий,следовательность остатков 3-5, являющаяся Аа А которые имеют способность превращаться в прото. пласты. Пример Е Через 2 дня клетки подкультивируют 115 в Сотрансформация и амплификация ФСК после- альфа-среде с 10 диализованной сыворотки тедовательности в СНО клетках. Плазмиду р 91023/В/- ленка пенициллином и стрептомицином, но без нукС вводят в НО ДГФР-дефицитные клетки деозидов. Затем клетки снова подают в ту же самую ДИКХ-В (77 4216, 1980) селективную среду (лишенную нуклеозидов) через 4 путем слияния протопластов, как описано (- 5 дней.. о 1, 743-752, 1981). Рост и Колонии появляются через 10-12 дней после поддержание СНО клеток описаны (Кауфман и субкультивирования в селективной среде. Следовали Шарп, . Мо. Во, 150, 501-621 (1981. Для слияния двум схемам отбора на метотрек сат (МТХ) и ампротопластов вводят 9023// в Е.плификации. В первой схеме изолируют единые неи выращивают бактерии в 50 мл м 9 солей, содер- зависимо клонированные трансформанты на основе жащих 0,5 казаининовых кислот, 0,5 глюкозы, экспрессии ДГФР и выращивают последовательно 0,0124, 5 мкг/мл тиамина и 10 мкг/мл тет- каждый клон в условиях для амплификации числа рациклина до поглощения 0,6 при 600 нм. Добавля- копий вышеуказанной ДНК, а именно рост при увеют хлорамфеникол до 250 мкг/мл и инкубируют личивающейся концентрации метотрексата. По втокультуру при 37 С дополнительно 16 часов для рой схеме изолируют пул из множественных незавитого, чтобы амплифицировать число копий плазми- симых трансформантов на основе ДГФР экспрессии 18 8562 и размножают вместе в условиях амплификации 3110 08 (.геп,78 (1981) указанной выше ДНК, а именно рост при повы- 4204-4208). шающихся концентрациях метотрексата. Затем изоФрагментДНК (нуклеотиды 34499 - 38 214) лируют индивидуальные клоны из массы отобран- интегрируют в хромосому 3110 08 у аС ной популяции и анализируют на -Ф экспрес- локуса. Интеграцию осуществляют с использованисию. Эти клоны, показывающие самые высокие ем вектора интеграции, состоящего из рВ 325 поуровни экспрессии, снова выращивают в условиях следовательностей,несущих гены для редальнейшей амплификации вышеуказанной ДНК (а зитентноти к хлорамфениколу и ампициллину, а именно рост в условиях повышающейся концентра- также рВ 322 источника репликации. (. ,ции метотрексата в культуральной среде)., 4 (1978), с. 121-136). ВставляютДНК В одном эксперименте семь ДГФР трансфор- фрагмент вген, который сам находится в плазмантов объединяют в альфа-среду, лишенную нук- миде в качестве фрагмента, простирающегося от леозидов. Эти клетки последовательно выращивают айтавас до айтавниз от ас. при постепенном увеличении концентраций МГХ,ИнтеграцияДНК в хромоомальную копию начиная с 0,02 М, затем 0,1, 0,5 и 2,0 М МТХ.ас дотигается гомологической рекомбинацией, и При пробе на -ФСК-активность в - пробе находят , чувствительные к ампициллину, резиклеток эти клетки продуцируют от 3000 до стентные к хлорамфениколу колонии. Второй ре 12000 единиц/мл. Отобранную популяцию клониру- комбинационный случай приводит к удалению всех ют при 0,5 М.МТХ и в 2,0 М.МТХ. Клоны, по- экстра-плазмидных последовательностей, но приволученные в 0,5 М.МТХ (010, Д 2 и В 6) последова- дит к тому, что интегрированныйДНК фрагмент тельно отбирают для роста в 2,0 .МТ. При ис- скринируется на лактозных пластинах МакКонкея. пытании на -ФСК активность в пробе на - Во втором рекомбинантном случае исходный ,клетках клонированные клеточные линии продуци- , са фенотип изменяется на -, ар, са руют от 15 000 до 300 000 единиц/мл -ФСК ак- фенотип. Полученный в результате штамм назван тивности. М-ФСК, продуцированный согласно 400 и являетсяпри 30 ипри 42 С. Этот этому примеру, имеет аминокислотную последова- фенотип демонстрирует существование функциотельность, приведенную для ФСК-Т на рис.1. нальной хромосомальной копии 857 аллеля. Пример Г 400 даетпри Р трансдукции из лизата,Экспрессия М-ФСК в . выросшего на штамме 20252 ( и 1169, ага-185, схематическое описание которого скринированием нана селективной среде. (. приведено на рис. 6. Последовательность, кодирую- ,и .145 (1981) 1110-1112). щая -ФСК, начинаетсясинтетической последоГотовый штамм-хозяин называется 1413 вательности САТ.ССА.ССА.ССТ.ССТ.ТСТ.ССА. (08,( , РЕХ,1100). ТСТ, которая определяет начальные-185 трансформируют в 1413. Куль аминокислотных остатков зрелого -ФСК. Ос- туру этого штамма выращивают всю ночь при 30 С тальная последовательность, кодирующая М-ФСК, в 5 мл индукционной среды, содержащей 7 мкг/мл в рТАС-185 является идентичной последователь- тетрациклина. Индукционная среда содержит, на ности рС-1 нуклеотиды 97-447 вслед за последова- 1 л тельностью Сразу после триплетно 20 г. казаининовых кислот,го терминатора имеется р-18 полилинкер, Гн 6 г. а 2 НРО 4. 72 резистентности к тетрациклину из рВ 322 был 3 г. 24 вставлен в противоположной ориентации к ФСК 0,5 г.гену, 100 оснований вниз от с-18 полилинкера. 1 г. 4 Ген резистентности к тетрациклину несет свой соб 1 глицерина ственный промотор. По движению против часовой 2 мг витамина 1 стрелки имеется следующий ген для -лактамазы 2 мг 2. 22 вслед за рс-18 (СоЕ) источником репликации. 0,2 г. 2. 6 Н 2 О Конечным структурным признаком плазмиды Инокулируют 25 мл этой среды, содержащей перед возвращением к ФСК последовательностям 7 мкг/мл тетрациклина, 125 мкл ночной культуры и является Р промотор. Этот промотор по существу встряхивают при 30 С на водяной бане до тех пор,описан А.Скатцманом и М.Розенбергом (в Лабора- пока культура не достигнет плотности при А 550 0,5. торном руководстве по молекулярному клонирова- Затем быстро переходят на 40-ную водяную баню и нию (1982), Колд Спринг Харбор Лаборатори, с. встряхивают еще 2 часа, чтобы дать возможность 419). ФСК экспрессия обеспечивается Р промото- пройти синтезу -ФСК. Собирают урожай клеток ром после термической индукции в подходящем и проверяют их на содержание ФСК электрофорезом штамме-хозяине . на СДС-полиакриламидном геле. В этих условиях Родительский штамм, используемый для конст- -Ф аккумулируется приблизительно до 5 от руирования всех штаммов, представляет собойклеточного белка. 19 8562 Пример С ют промотор сав дрожжевой вектор эксЭкспрессия Д. Изоляция гена для фактора А. Вектор конструирования Из дрожжей изолировали ген для фактора ,Конструируют плазмиду, которая содержит ген зреющего феромона ( а Н, С 30 для фермента в урацил, биоинтетическом пути . . 933-943 (1982. Олигонуклеотидный зонд, син(РАЗ) в качестве гена селекции и 2 источника реп- тезированный из этой последовательности, испольликации. Эта плазмида происходит из 5 ( зуют для изоляции гена из плазмидной библиотеки, 8, . с. 17-24 (1979 добавлением фраг- дрожжевой геномной ДНК по стандартным методимента, содержащего источник репликации из 2 мик- кам. рон плазмиды дрожжей. Е. Получение плазмиды экспрессии ФСК В. Изоляция гена для глицеральдегид фосфат Конструируют по стандартным методикам из дегидрогеназыописанных выше элементов и гена человеческого Изолировали из дрожжей два гена для СГДН ФСК вектор экспрессии ( А 14, рис. 7). В этом век(торе удалили природную лидерную последователь 255, .с. 2596-2605 (1980. Олигонуклеотидный ность ФСК и вставили последовательность, кодизонд, синтезированный из опубликованной последо- рующую зрелый ФСК, вблизи пре-про последовавательности, используют для изоляции ГДН гена тельностифактора. Соединения между СРДН из плазмидной библиотеки дрожжевой геномной промотором, пре-про последовательностьюфакДНК по стандартным методикам. Плазмида, содер- тора и последовательностью зрелого ФСК уточнены жащая целый Р 491 ген, была депонирована ранее (ниже) и были подтверждены деоксинуклеотид(АТСС 39777). ным секвенсированием. А. С. Получение промотора глицеральдегид фос-ААА,фат дегидрогеназы для экспрессии гетерологическо- .го гена Г. Экспрессия -ФСК Конструируют плазмиду, которая позволяет Плазмиду А 14 трансформируют в штамм природное распределение ДН промотораначала. Культивируют клетки для гетерологического структурального гена. Это осуще- продуцирования ФСК. Мы выделяем в нашем изоствляется при введении Кр 1 сайта в непосредствен- бретении следующие моменты ной близости к инициирующему метиониновому кодону РДН структурального гена. Затем вставля 20 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения белка с активностью гранулоцитомакрофаг-колониестимулирующего фактора (-) приматов, включающий культивирование хозяйских клеток после их трансформации рекомбинантным вектором, обеспечи вающим экспрессию в выбранном типе клеток встроенного в указанный вектор гена, кодирующего - приматов, отличающийся тем,что для трансформации клеток хозяина используют рекомбинантный вектор с геном, кодирующим полипептид со следующей аминокислотной последовательностью и полученный продукт выделяют и очищают. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что упомянутая хозяйская клетка представляет собой дрожжевую клетку.3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что упомянутая хозяйская клетка представляет собой прокариотическую клетку. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что упомянутая хозяйская клетка представляет собой клетку 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что включенный в рекомбинантный вектор ген коди рует - приматов с аминокислотной последовательностью, приведенной в п. 1 для -. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что включенный в рекомбинатный вектор ген кодирует - приматов с аминокислотной последовательностью, приведенной в п. 1 для -. 7.Способ по п.1, отличающийся тем, что включенный в рекомбинатный вектор ген кодирует - приматов с аминокислотной последовательностью, приведенной в п. 1 для -. Верстка Казпатент, исполнитель Л.Н.Анищенко Ответственный за выпуск Э.З.Фаизова Корректор А.Б.Вышкварко