Способ индикации вируса чумы крупного рогатого скота в объектах внешней среды

(51) 61 39/00 (2010.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ вируса чумы КРС в объектах внешней среды и выявление искомого антигена методом твердофазного ИФА без предварительного подращивания возбудителя болезни. Способ осуществляется путем перевода тврдых инфицированных проб из объектов внешней среды в жидкую фазу, концентрирование жидких проб на мембранные фильтры, элюцию вируса с фильтров и выявление искомого антигена в прямом методе ИФА,без предварительного подращивания возбудителя болезни. Способ позволяет выявить вирус чумы КРС из воздушной среды в дозе 10 ТЦД 50/л, а из воды, сена и зерна в дозе 100 ТЦД 50/мл/г и выше. Предлагаемый способ может быть применн для эффективного выявления антигена вируса чумы КРС из различных заражнных объектов внешней среды при эпизоотии болезни без подращивания возбудителя.(72) Матвеева Валентина Михайловна Мамадалиев Сейдигапбар Мамадалиевич Кошеметов Жумагали Каукарбаевич(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ИНДИКАЦИИ ВИРУСА ЧУМЫ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В ОБЪЕКТАХ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ(57) Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к методам диагностики и индикации вирусов в различных объектах внешней среды. Задачей изобретения - разработка схемы подготовки проб для специфической индикации Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к методам диагностики и индикации антигенов вирусов в различных объектах внешней среды и представляет собой новый способ индикации вируса чумы КРС в объектах внешней среды. Аналогов по предлагаемому способу индикации вируса чумы КРС в объектах внешней среды нами не обнаружено. Задачей изобретения является разработка схемы подготовки проб для специфической индикации вируса чумы КРС в объектах внешней среды и выявление искомого антигена методом твердофазного ИФА без предварительного подращивания возбудителя болезни. Указанные условия повышают в 10-100-раз (по сравнению с раннее разработанными способами индикации вируса чумы КРС) эффективность индикации антигена в объектах внешней среды и обеспечивают обнаружение возбудителя болезни из воздушной среды в дозе 10 ТЦД 50/Л, а в пробах воды, сена и зерна в дозе 100 ТЦД 50/мл/г и выше. Данный способ индикации вируса чумы КРС в объектах внешней среды предусматривает инфицирование тестобъектов (воздух, вода, сено и зерно) разными дозами вируса чумы КРС, перевод твердых проб в жидкую фазу с помощью элюции вируса с тврдых проб соответствующим буфером, концентрирование жидких проб на мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, десорбцию антигена с фильтра тем же буфером и исследование приготовленных таким образом проб в прямом твердофазном методе ИФА,без предварительного подращивания возбудителя болезни. Способ индикации вируса чумы крупного скота в объектах внешней среды осуществляют в следующей последовательности Пример 1. Культуральным вирусом чумы КРС инфицируют воду в объме 500 мл, сено и зерно по 100 г в дозе 100 ТЦД 50 /мл/г, после 5 минутной инкубации при комнатной температуре избыток вируса удаляют. Элюцию вируса с тврдых проб осуществляют 5 кратным объмом фосфатносолевого буферного раствора (ФБС) в течение 5 минут при интенсивном встряхивании. Собранный элюат концентрируют на мембранные фильтры типа Владипор или Миллипор с диаметром пор 0,22 мкм с помощью вакуумного насоса марки Миллипор или другого аналогичного прибора с насадкой для фильтра. Элюцию антигена с фильтра проводят минимальным объмом (1-2 мл) 0,01 М ФБС, содержащего 0,5 твина 80 методом пипетирования в течение 10 минут. Собранный элюат осветляют центрифугированием при 10001500. Надосадок исследуют в прямом варианте ИФА. ИФА осуществляют по следующим разработанным нами условиям постановки сенсибилизация полистироловых плоскодонных планшетов специфическим иммуноглобулинам,взятым в рабочей концентрации при рН-9,5 в течение в течение 18 часов при 4 С- контакт испытуемых и контрольных проб антигенов с закрепленным на полистироле иммуноглобулином в течение 18 часов при 4 С взаимодействие вирусоспецифического конъюгата с антигенами в течение 60 минут при 37 С, а затем рабочего раствора субстрата с конъюгатом в течение 30-60 минут при комнатной температуре. Учет результатов ИФА проводят визуально по интенсивности окраски субстрата или на фотометре марки Мультискан при длине волны 405 нм по разнице оптической плотности испытуемой и контрольной (отрицательной) пробы.- Пример 2. Культуральный вирус чумы КРС распыляют в вертикальной динамической камере(ВДК) с помощью аэрозольного ингалятора в течение 5 минут в дозе 10 ТЦД 50/л и выше. Отбор проб проводят на фильтры ФПП-15-1,5 или НЭЛ-3 с помощью вакуумного насоса Миллипор с насадкой для фильтра в течение 90 минут, при этом пропускают через фильтр не менее 2500 литров воздуха. Антиген с фильтра элюируют в 1,5 мл 0,01 М ФБС с 0,5 твина 80 в течение 2 часов при 4 С. Элюаты исследуют в прямом методе ИФА по вышеописанным параметрам постановки реакции. Предлагаемый способ может быть применн для эффективного выявления антигена вируса чумы КРС из различных заражнных объектов внешней среды при эпизоотии болезни без подращивания возбудителя. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ индикации вируса чумы крупного рогатого скота в объектах внешней среды,включающий инфицирование тест-объектов разными дозами вируса чумы крупного рогатого скота, перевод тврдых проб в жидкую фазу,концентрирование жидких проб на мембранные фильтры, элюцию вируса с фильтров и выявление искомого антигена в прямом методе ИФА без предварительного подращивания возбудителя болезни.