Способ получения смеси милбемицинов альфа11, альфа 12, альфа 13, альфа 14 и альфа 15

81 представляет собой метильную группу. этильную группу. вторичную бутильную группу или группу формулы С(СНз)СНВ 5. в которой 85 представляет собой метильнуюгруппу. этильнуго группу или изопропиль ную группугт представляет собой группу формулы -(СН 2)С(8 в)С(Н 7)(Нв). в которой пдпредставляет собой О. 1 или 2. Кв и 27 каж дый представляет собой атом водорода илиметильную группу. -и На является атомом водорода. алкильной группой С 1 С 4. фе нильной группой. или фенильной группой,замещенной ОДНИМ ИЛИ более ЭТОМОВ ГЗПО гена, метильнойили нитрогруппами Пз представляет собой атом водорода. тиетильную группу. гидрокси-еащищающую группу или остаток. образующий сложный эфир-карбоновой кислоты. или кислотный оста ток и 84 представляет собой атом водорода или альфа-1 юлеандросил-альфа-Я-олеанд 3081росилокси-группу. при УСЛОВИИ, ЧТО 124 пред- ставляет собой атом водорода. когда группа Вт представляет собой метьяльнуло группу. зтипьную группу. или группу формулы С(СН 3)СНН 5. в которой Па является метил ьн ой группой. этильной г-руппой или изопропильной труппой. . Вещество по изобретению может исполь зоваться в параэитицидной композиции. -которая может иметь антигельминтную, акарицидную. инсектицидную или прочую ак тивность. Эта композиция включает вещест во формулы в смеси с фармацевтически.сельскохозяйственно. ветеринарно или садоводчески приемлемым носителем илиКроме того. ато изобретение обеспечивает также обработку или защиту животных4 (в том числе людей) или растений от повреж дения у паразитами. выбранными из акари ДОВ. гельминтов И НЭСЗКОМЫХ. причем ЭТОТд СПОС 0 б включает применение ИЛИ НЗЗНЗЧЗние вещества формулы (1) названным животным. указанным растениям или семенам указанных растений. или на место обитания указанных животных. растений или семян.Некоторые из веществ формулы могут быть получены как ферментационные продукты.Изобретение обеспечивает способ полУЧЭНИЯ Вещества формулы (п. в которой ехд У- представляет собой группу СН 2 СН 2 Ка и Ю каждый представляет собой атом водорода и 1) 81 является метильной груп пой, а Н 2 представляет собой 2-метил 1-про пенильную группу. 2) На является метильной уГРУППОЙ. И 2 представляет 2-метил-1-бутенильную группу. или 3) Кт является этильной группой. а 82 представляет собой 2-метил 1 пропенильную группу.Здесь такие вещества называются милбемицинами эльфам (возможность 1). приведенная выше), альфа 13 (возможность 2). приведенная выше) и эльфам (возможность 3). данная выше). Они могут быть получены путем культивирования продуктивных мик роорганизмов рода Зтгертотусеэ. Такой микроорганизм представляет собой штамм ЗАМК 60286. принадлежащий к роду Зтгерготусев. который был выделен из почвы города Миура. префектура Канагава. Япония.. Милбемицины альфа 11.альфа 1 з и аль фат образуют часть ряда веществ. которые выделены из ферментационного бульона Зъгертотусезштамм ЗАМК 60286 и названы мипбемицинами от альфап до альфа 15, какальфатз этил изобутилХарактеристики Зтгертотусеэ ЗАМК 60286микологические свойства актиномицетов штамма ЗАМК 60286 приведены ниже.- Этот штамм. как показано микроскопически. имеет разветвленный от светло-желтогодо желтовато-коричневого основнойМИЦЕЛИЙ. ИЗ КОТОРОГО УДПИНЯВТСЯ ОТ белогоцепочке спор наблюдаются 10 или болееспорв линию. причем споры имеют бородавчато-морщинистую поверхность. Этот штамм образует в некоторых типах сред прозрачную золотую слизь на поверхностия аэриального мицелия. причем эта слизь из меняется до желтоватых пятен в процессекультивирования. Иногда образуются чер новатые пятна вследствие влажности на поздней стадии культуры.2. Рост на различных средахЭтот штамм проявляет свойства. которые показаны в табл. 1 после культивирования при 28 С в течение 14 суток на различных средах. Использованные здесь названия цветов и номера были приписаны на основании Правила по стандарту цвета. справочника. опубликованного фирмой Ниппон Шикисай Кенкюшо.После культивирования при 28 С в течение 14 суток на среде Придхам-Готтлибова агара. для штамма ЗАМК 60286 отмечено использование источником углерода. как показано ниже.Стенка клеток штамма ЗАМК 60286 была исследована в соответствии со способом,описанным В.Весег с сотрудниками в журнале(АррПео М 1 сгоЫоо 9 у 12. 421 (1964). Так как 1. 1-диаминопимелиноваякислота и гли ц цин могут быть детектированы, было пока зано. что клеточная стенка относитсяк стенке типа 1. Затем сахарные компонентынале (Д от Ьабогатогу апо Спмса Меоспе. 1968. том. 71. 934).-Не наблюдалось никакихВ итоге. былопоказанщчто зтот штамм принадлежит к роду Зггертотусез актиномицетов. с Идентификация Зсгертотусез штамм ЗАМК 60286 была осуществлена в соответ ствии со стандартом Р (Международнаяу во всех клетках были исследованы согласно методу, описанному М.Р.1.еслеча-.егв жур Программа Зггертотусез) Бергеевским исправочником определительной бактерио логии восьмое издание книгой ЗХААА/акзтап. Асппотусетез и другими недавними работами по актиномицетам.Когда свойства штамма ЗАМК 60286 были сопоставлены с таковыми для других из вестных видов рода Зтгертотусез. то морфологические и физиологические свойства были почти идентичны таковым для Зтгертотусез пуогозсорйсиз субспоры аигеочасгйтозиз (д. Атбыоисз. том. 36. 438(1983). Однако наблюдалось небольшое различие в свойствах культур между этими двумяактиномицетов изменяются в некоторой степени даже для того же самого штамма после нескольких последовательных выращивании. Поэтомуштаммы не всегда могут быть дифференцированы таксономически из-за небольшого различия в свойствах культуры. л .По этим причинам. штамм ЗАМК 60286. который продуцирует Милбемицины альфан. .альфа 12. альфатз. гльфам и альфатз. был идентифицирован как Зтгертотусеэ Ьуогозсорйсиз субспоры аигеыасптозиз ЗАМК 60286. Этот штамм был депонирован в соответствии с постановлением Будапештского Договора от 20 октября 1986 г при Исследовательском институте ферментации. Япония. причем ему присвоен вступительный номер РЕРМ ВР 119 О. Образцы этого штамма могут быть доступны по соответствующим постановлениям Будапештского Договора.Актиномицетььвключающие Зтгерсотусез луогозсордсо 5 субспоры аигеыасгйтоэпз ЗАМК 6028 б.-легко претерпевают мутацию как в результате естественных факторов. так и в результате искусственных обработок. таких какобработка и химическая обработка. Настоящее изобретение охватывает все продуктивные мутанты штамма ЗАМК 60286. Эти мутантные штаммы также включают любые штаммы. которые получают генным манипулированием. таким как геннаяцияь Иными словами. это изобретение включает все такие - штаммьцкоторые могут производить один или несколько милбемицинов эльфам. альфатз и альфам. и особенно штаммы. которые не могут быть четкодифференцированы от штамма ЗАМК 60286или его мутантов. у Милбемицины альфап. альфа 1 з И альфам могут быть получены путем культифи рования штамма БАМК 60286 в подходящей среде и путем отбора милбемицинов из этой среды. В качестве питательных веществ могут быть использованы традиционные соединения. которые обычно применяются для выращивания микроорганизмов родаЗтгерютусев. Например. источником углерода может быть глюкоза. сахароза. крахмал. глицерин. густой солодовый сироп.МОЛЯССЫ ИЛИ соевое МЗСЛО. КПОМС ТОГО ДЛЯпримера. источником азота может быть соевый порошок. пшеничные зерна. мяснои экстракт. пентон. дрожжевые клетки, жидкость для замачивания кукурузы. сульфат аммония или нитрат натрия. В случае необходимости. в подходящем сочетании могут быть использованы органические и неорганические добавки. которые промотируют рост микроорганизмов и активируют производство милбемицинов альфап. апьфатз И альфа 14.а также неорганические соли. та КИе КЭК карбонат кальцияцхлорид натрия Ич Наиболее пригодным для культивирования микроорганизмов является жидкостное выращивание. в особенности глубокая жидкостная культура которая используется та КИМ же СПОСОбОМ. КЗК И В ТрЭДИЦИОННЫХ способах получения антибиотиков. Выращивание проводится аэробно. Подходящая температура для выращивания составляет от 22 С до З 0 С. причем в большинстве слу чаев выращивание проводится около 28 С.Производство милбемицинов альфап. альфааз и ал ьфам обычно достигает- максимума через 5-15 суток или при выращивании со встряхиванием. или при выращивании в емкости. Получение милбемицинов альфап. альфатз И эльфам может. быть прослежено с помощью следующей методики Один миллилитр культивируемого материала отбира ют внебольшую пробирку и добавляют 9 мл80-ного водного метанола. Пробирку встряхивают и центрифугируют. Используют жидкостную хроматографию высокого разрешения (такую как Эйч 2151. колонка с обратной фазой Оут-ди-Ос размером 6 х 150элюируют ее смешанным растворителем из ацетонитрила и своды (80 20) при скорости потока 1.5 мл/мин. Милбемицины альфан. альфаю и альфаи, регистрируются с помощью блока обработки данных (такого как Эм-Си-Пи-Ди-ЗБО Пи-Си фирмы Юнион Тех. Инструм.).Для отбора милбемицинов альфап. альфатз и альфаи из культурной среды может использоваться адсорбенлтакой как активгаыйуглерод. оксид алюминия или силикагель синтетический адсорбент. такой как(фирма Асахи Хем. Инд. Ко. Лтд) или Фильтровальная бумага Ионообменная смола или фильтрующий материал ионообменного геля. Наиболее эффективна следующая методика.культивируемый материал фильтруетсясиспользованием фильтрующего средства. такого как диатомит. Полученная при филь тровании лепешка экстрагируется метанолом, для тогочтобы растворить целевыесоединения в водном метаноле. Добавляют воду. и смесь экстрагируют гексаном. Гексановый раствор выпаривают при пониженном давлении, получая маслянистоеВЕЩЕСТВО, КОТОрОВ СОДВОЖИТ МИЛбеМИЦИНЧальфа 1 1. ал ьфаю и эльфам. Это маслянистое вещество. содержащее милбемицины альфап. альфатз и эльфам, адсорбируют на колонке Лобар 55 60 (фирме Мерк. размер Би) и элюируют его смешанным растворителем из гексана и этилацетата (80 20). отбирая фракции, каждая из которых содержит милбеглицины альфап. альфаю или эльфам.Каждую фракциюрсодержащуго любой измилбемицинов, выпаривают при пониженном давлении. получая маслянистое вещество. Это масло смешивают с небольшим количеством метанола. адсорбируют раствор на колонке Лобар АрМи 8 (фирма Мерк. размер Би) и элюируют смешанным растворителем из ацетонитрила и воды (8020). (Собирают фракции. каждая из которых . содержит одно из целевых веществм послеотгонки ацетонитрила при пониженном давлении экстрагируют этилацетатом. Оконча тельно каждый из милбемицинов альфап. альфа 1 з и альфам может быть получен в виде порошка методом жидкостной хрома тографии высокого разрешения (колонка с обратной фазой). Милбемицины альфап и альфа 15 также могут быть получены аналоВещества формулы этого изобретения обладают превосходной акарицидной активностью против взрослых особей и яицу двупятнистого паутинного клещика(Теггапуслив). цитрусового красного клещика (Раполуспиз), Европейского красного клещикаби ржавчинных клещиков. которые являются паразитами для фруктовых деревьев. овощей и цветущих растений и против Кхоодвегтапузздое. Загсорпоае идругих ПЭРЭЗИТОВ. КОТОРЫЕ ПЗОЗЗИТИРУЮТ на дживотных. Кроме того. эти вещества обладают активностью против Оеэтгиз. Ьиссдпа. Нурооегта. Баисгорлпиз. блох и вшей. сре ДИ которых ДрУГИЗ ЯВЛЯЮТСЯ ПЭПЗЗИТЗМИ В оОТНОШЕНИИ ЖИВОТНЫХ И ПТИЦ ДОМЗШНИХ на секомых. такие как тараканы. домашние мухи и других насекомых и различных насекомых. вредоносн ых для сельскохозяйственных и садовых культур, таких как тля, капустная моль и гусеница Ьершоркега. Кроме того. вещества этого изобретения обладают активностью против Меюшооупе, Вигзарбеюпспиз. Рыгоспурпиз и других видов в почве.Кроме того. вещества -этого изобретения обладают превосходной паразитицидживотных и человека. В особенности эти вещества являются эффективными не только против нематод. паразитирующих на домашних животных и домашних птицах и животных. таких как свинья. овцы. козы. крупн ьтй рогатый скот. лошади. собаки, кршки и пернатая дичь. но также против паразитов. обнаруженныхв пищеварительных трактах, крови и других тканях и организмах людей и паразитов, принадлежащих к роду РНагПоае или Зегагпоае.Когда вещества этого изобретения предназначаются для использования в сельскохозяйственных или садоводческих целях. они могут составляться в виде препаратов, которые традиционно использовались для сельскохозяйственных химикалиев. таких как дусты. увлажняющиеся порошки. эмульгирующиеся концентраты. водные или маслянистые суспензии иаэрозоли, путем смешивания их с носителя-ми или дрУГимиувспомогательными агентами в случае необходимости. Носители могутбыть природными или синтетическими и неор ГЗНИЧВСКИМИ. ИЛИ ООГЭНИЧВСКИМИ ВЕЩЕСТВЭМИ, которые вводятся в сельскохозяйственные рецептуры для того. чтобы способствовать достижению цели активным компонентом и сделать его более удобным для хранения, транспортаЧто касается удобных твердых носителейддесь могут быть упомянуты неорганические вещества. такие как глинывермикулит, гипс. карбонат кальция. доломит, диатомитовая земля. карбонат магния,апатит. цеолит, кремниевый ангидрид и синтетический силикат кальция растительные органические вещества, такие как соевый порошок. табачная пыль, ореховая пыль, пшеничная мука. древесная мука. крахмал и кристаллическая целлюлоза синтетические или природные высокомолекулярные вещества. такие как кумароновые смолы, нефтяные смолы. алкидные смолы, поливинилхлорид,полиалкиленгликоли, кетоновые смолы.сложноэфирные смолы, смолы камеди и даммаровые смолы воски, такие какооск карнаубы и пчелинный воск и мочевина. Что касается жидких носителей, то здесь могут быть упомянуты парафиновые или нафтеновые углеводороды. такие как керосин. минеральные масла. веретенноемасло и белые масла ароматические углево-дороды. такие как бензол, толуол. Ксилол,этилбензол, кумол и метилнафталин хлорированные углеводороды. такие как четыреххлористый углерод. хлороформ.трихлорэтилен монохлорбензол и орто хлортолуол простые эфиры. такие как диок сан и тетрагидрофуран кетоны. такие какацетон, метилэтилкетон, диизобутипкетон,циклогексанон. ацетофенон и иэофорон сложные эфиры. такие как этилацетат, амилацетат. этилен гликоль-ацетат, ацетат диэтиленгликоля. дибугилмалеат, диэтилсукцинат спирты. такие как метанол. н-гексанол. этиленгликоль, дизтиленгликолъ, циклогексанол и бензиловый спирт простые эфиры спиртов,такие как этиловый эфир этиленгликоля. фениловый эфир этиленгликоля, этиловый эфир диэтипенгликоля и бутиловый эфир диэтиленгликоля полярные растворители, такие как диметилформамид и Диметилсульфоксид и вода. .Что касается подходящих газообразных носителей, то могут быть упомянуты воздух,диоксид углерода и фреон (торговая марка). Эти газы могут быть смешаны для распыления.Для того чтобы улучшить такие свойства рецептуры, как диспергирование. эмульгирование. распространение. проникновение и прилипание. в случае необходимости могут быть добавлены различного типа поверхност НО ЭКТИВНЫЗ ЗГЗНТЫ И ВЫСОКОМОПВКУПЯРНЫЗ СОединения. посредством которых могут бытьусилены увлажняемость. адгезия и адсорбция рецептуры на животных и растениях для повышения их эффективности.Что касается поверхностно-активных агентов. которые могут применяться для змульгированъгя. диспергирования, увлажнения. распространения. связыванижрегулирования измельчения. стабилизации активных компонентов, улучшения текучести и предотвращения образования ржавчины, то могут использоваться любые неионные. анионные. катионные и амфотерные типы, но среди них обычно используются неионные и/или анионные поверхностно-активные агенты. Что касается пригодных неионных