Консорциум рекомбинантных штаммов Flu-NS1-124-L7/L12-H5N1, Flu-NS1-124-Omp16-H5N1, Flu-NS1-124-L7/L12-H1N1 и Flu-NS1-124-Omp16-H1N1 вируса гриппа А, семейства Ortomyxoviridae, рода Influenzavirus, экспрессирующие бруцеллезные иммунодоминантные белки, предназначенные для получения противобруцеллезной вакцины

(51) 12 7/00 (2006.01) 61 39/10 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ быть использовано в качестве векторной вакцины для профилактики бруцеллеза. Сущность изобретения состоит в том, что с помощью метода обратной генетики сконструирован консорциум новых генетически стабильных, безопасных и иммуногенных рекомбинантных штаммов -1124-7/12-51, -1-124-16-5, 1-124-7/12-11, -1-124-16-11 вируса гриппа А (гриппозные векторы) субтипов 51 и 11, семейства , рода,содержащие генетические последовательности вставок бруцеллезных белков 7/12(поверхностный мембранный) в 1 гене,экспрессия которых происходит в инфицированной клетке ( ). Для вакцинации животных используются моно или бивалентные (смесь вирусов) рекомбинантные штаммы в режиме прайм(вирусами субтипа 51) и бустерной (вирусами субтипа 11) иммунизации с использованием интраназального,конъюнктивального или подкожного способов введения. Все полученные рекомбинантные вирусы безопасны, способствует формированию выраженного Т 1 клеточного иммунного ответа, а также высокой степени защиты от вирулентного штамма В.544,сопоставимой с коммерческой живой вакциной из штамма В.19. Иммунизация животных вирусными конструкциями создает возможность не только для эффективной дифференциации вакцинированных животных от инфицированных,но и дает возможность выявить поголовье больных бруцеллезом животных в вакцинированной группе.(72) Сансызбай Абылай РысбайулыТабынов Кайсар КазыбаевичЕспембетов Болат Аманбаевич Султанкулова Куляйсан ТурлыбаевнаХайруллин Берик Мухитович Сандыбаев Нурлан ТамамбаевичЕгоров Андрей Юрьевич(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики КазахстанЭйч-Эс-Си Девелопмент Джи эм би Эйч(54) КОНСОРЦИУМ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ -1-124-7/12-51, 1-124-16-51,-1-124-7/1211 И -1-124-16-11 ВИРУСА ГРИППА А,СЕМЕЙСТВА,ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ БРУЦЕЛЛЕЗНЫЕ ИММУНОДОМИНАНТНЫЕ БЕЛКИ,ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВОБРУЦЕЛЛЕЗНОЙ ВАКЦИНЫ Изобретение относится к области биотехнологии,ветеринарии и медицины, может быть использовано в качестве векторной вакцины для профилактики бруцеллеза. Известен аттенуированный штамм Х 4072 серовар , способный экспрессировать бруцеллезный рибосомальный белок 7/12 и(люмазин фермент синтазы)у мышей при пероральном способе иммунизации. Иммунизация этим штаммом способствовало формированию у мышей специфичного к бруцеллезу мукозального и 1 клеточного иммунного ответов. По показателю степени защиты (протективность) от вирулентного штамма В.544 векторная вакцина,основанная на штамме Х 4072,была сопоставима с субъединичной(рекомбинантные белки -7/12) и ДНКвакциной (17/12), однако значительно уступала живой аттенуированной противобруцеллезной вакцине из штамма В.104 М, что и является ее основным недостатком.,.,.,.,.,., .,.7/12// . - 2009. . 27. .5214-5219. Наиболее близким к заявляемому изобретению по совокупности существенных признаков(прототипом) является рекомбинантный вирус(название национального парка в Уганде), экспрессирующий белки В.супероксиддистумазу (- ) или фактора инициации трансляции 3 (3)у мышей при внутрибрюшинном способе введения. Указанный вектор несмотря на дефектность реплекативного механизма обладает инфекционностью для широкого спектра хозяев, у иммунизированных мышей формирует ярко выраженный 1 4 и 8 Т-клеточный противобруцеллезные иммунные ответы. Использование этого вектора с указанными бруцеллезными вставками обеспечивает защиту мышей при их контрольном заражении В.2308, которая была сопоставима с таковой живой вакциной из штамма 51 А.А.,.,- .,.,.,.,////// . - 2009. - . 214,6. .467-474. Недостатком данного вектора является то, что сведения о безопасности этого вируса для сельскохозяйственных животных недостаточны, и данное обстоятельство может послужить основанием для ограничения вакцинации против бруцеллеза с использованием этого вектора. 2 Сущность изобретения состоит в том, что с помощью метода обратной генетики сконструирован консорциум новых генетически стабильных,безопасных и иммуногенных рекомбинантных штаммов -1-124-7/1251, -1-124-6-51, -1-1247/12-11 и -1-124-16- вируса гриппа А (гриппозные векторы) субтипов 51 и 11,семейства,содержащие генетические последовательности вставок бруцеллезных белков 7/12(крупнорогатый скот, овцы, козы, свиньи и д.р.) в настоящее время проводиться с использованием живых вакцин из аттенуированных штаммов В.19,51 и 1. Указанные вакцины обладают высокой иммуногенной эффективностью,но при этом не лишены и серьезных недостатков,связанных в первую очередь с возможностью вызывать аборты у стельных коров, секрецией вакцинного штамма в молоко вакцинированных животных, реверсии, а также сложностью дифференциации вакцинированных животных от инфицированных,., ,//. - 2002. - . 90. .479-496. Более того вакцинные штаммы обладают патогенностью для людей,., .,,.,.51 // . - 2004. . 22. .3435-3439. Перечисленные недостатки коммерческих вакцин послужили причиной для ограничения вакцинации во многих неблагополучных по бруцеллезу странах, что еще более усугубило эпизоотическую ситуацию по данному заболевания в мире. Исходя из вышеизложенного,в основу настоящего изобретения положена задача получения нового кандидата противобруцеллезной вакцины,обладающего схожей с коммерческими вакцинами иммуногенностью, но при этом лишенных их недостатков. Данная задача была решена с помощью новой стратегии в разработке безопасных и эффективных вакцин - использования живых генетически модифицированных векторов(непатогенные микроорганизмы), продуцирующих бруцеллезные антигены. Для этого методом обратной генетики сконструирован консорциум новых рекомбинантных штаммов -1-124-7/1251, -1-124-16-51, -1-1247/12-11 и -1-124-16-11 вируса гриппа А (гриппозные векторы) субтипов 51 и 11,содержащие генетические последовательности вставок бруцеллезных белков 7/12 Техническим результатом является то, что полученный консорциум рекомбинантных вирусов несмотря на дефектность их 1 генов, обладают хорошими репродуктивными свойствами в куриных эмбрионах (КЭ), генетически стабильны на протяжении пяти последовательных пассажей и экспрессируют фюжн белки 1-7/12 или 116 в инфицированных КЭ. Моно и бивалентные рекомбинантные штаммы в режиме прайм(вирусами субтипа 51) и бустерной (вирусами субтипа 11) иммунизации с использованием интраназального (и.н.), конъюнктивального (к.) и подкожного (п.к.) способов введения безопасны для мышей (не вызывают гибели, потери массы тела и патоморфологических изменений), способствует формированию ярко выраженного 1 клеточного(4 лимфоцитытипа) иммунного ответа, а также высокой степени защиты от вирулентного штамма В.544, сопоставимой с коммерческой живой вакциной из штамма В.19. Кроме того,иммунизация животных вирусными конструкциями создает возможность не только для эффективной дифференциации вакцинированных животных от инфицированных, но и дает возможность выявить поголовье больных бруцеллезом животных в вакцинированном стаде (группе). Существенными признаками, характеризующими изобретение, совокупность которых обеспечивает получение технического результата, а также отличающим его от прототипа являются 1) в качестве вектора для экспрессии бруцеллезных иммунодоминантных белков используется вирус гриппа 2) в качестве вектора для экспрессии бруцеллезных иммунодоминантных белков используются вирусы гриппа А субтипов 51 и Н 11 3) нуклеотидные последовательности,кодирующие бруцеллезные иммунодоминантные белки, вставляются в ген 1 (неструктурный) вируса гриппа 4) нуклеотидные последовательности,кодирующие бруцеллезные рибосомальный белок 7/12 или Ор 16 (поверхностный мембранный белок), вставляются в открытые рамки считывания гена 1 вируса гриппа в положении 124 аминокислоты 5) рекомбинантные штаммы вируса гриппа,экпрессирующие бруцеллезные белки 7/12 или Ор 16, культивируются в 10 суточных куриных эмбрионах при температуре 340,5 С в течение 48 часов 6) Для вакцинации животных используются моно или бивалентные (смесь вирусов) вирусные конструкции,экепрессирующие бруцеллезные белки 7/12 или/и Ор 16 в режиме прайм(вирусами субтипа 51) и бустерной (вирусами субтипа 11) иммунизации с интервалом 28 суток с использованием и.н., к. и п.к. способов введения. Сведения,подтверждающие возможность осуществления изобретения. Далее описаны предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения. Представленные ниже варианты осуществления описаны в интересах лучшего понимания изобретения, и понятно, что объем настоящего изобретения не ограничивается следующим описанием. Поэтому очевидно, что специалисты в данной области могут модифицировать любой способ осуществления,который целесообразен в пределах объема настоящего изобретения,при рассмотрении представленного здесь описания. Для лучшего понимания сущности изобретения ниже приводятся примеры его конкретного выполнения. Пример 1 Способ получения консорциума рекомбинантных штаммов -1-124-7/12-51, -1-12416-51, -1-124-7/12-11 и -1124-16-11 вируса гриппа А субтипов 51 и 11, экспрессирующих бруцеллезные белки 7/12 и Ор 16 Для этого рекомбинантный 1 ген сокращается в -терминальной области до 124 аминокислоты для вставки нуклеотидной последовательности,кодирующей белки В.7/12 ( ААА 19863.1) или 6 ( ААА 59360.1). Химерные сегменты клонируются в двунаправленную плазмиду 2000 Е., .,.,.,//. 2000. - . 97. .6108-6113, содержащуюиэкспрессионные кассеты для двунаправленной транскрипции сегментов вируса гриппа. Рекомбинантные вирусы получают по стандартной методикес незначительными изменениями. Для этого клеточную культуру(Американская коллекция клеточных культур),адаптированную к модифицированной питательной среде с добавлением 4-глютамина, трансфекцируют 0.5 мкг/мкл плазмидами, кодирующими гены ,РВ 1, РВ 2, , , М от вируса / /8/34/20/99 (11). Ген НА от вируса 51 модифицируют путем удаления сайта протеолитического расщепления, ответственного за патогенность вируса. За трансфекцированными клетками ведут наблюдение до появления 6 цитопатического действия (ЦПД). После проявления ЦПД клеточную культуру центрифугируют при 300 в течение 15 мин для отделения супернатанта. Полученным супернатантом инфицируют клеточную культуру(Американская коллекция клеточных культур). Через 72 часа после инфицирования во всех клеточных культурах, где имелись полноценно сконструированные вирусные конструкции, отмечаются ЦПД. Дальнейшее культивирование полученных рекомбинантных штаммов вируса гриппа проводят в 10-суточных куриных эмбрионах (КЭ, ) при температуре 340,5 С в течение 48 часов. В результате данной работы сконструирован консорциум четырех 3, рода , кодирующие с открытой рамки считывания гена 1 бруцеллезные белки 7/12 или Отр 16. Схематическое изображениегена вируса гриппа, а также химерных 1 генов рекомбинантных вирусов гриппа А субтипов 51 и 11, содержащих бруцеллезные антигены 7/12 или Ор 16 показано на рисунке 1 А и В. Пример 2 Генетическая стабильность консорциума рекомбинантных штаммов -1-124-7/1251, - -124-16-51, -1-1247/12-11 и -1-124-Ор 16-Н 11 вируса гриппа А субтипов 51 и 11, и оценка экспрессии бруцеллезных белков. С этой целью проводили 5 последовательных пассажей полученных четырех рекомбинантных штаммов -1-124-7/12-51, -1-12416-5, -1-124-7/12-11 и -1124-Ор 16-Н 11 вируса гриппа А субтипов 51 и 11 в 10-суточных КЭ. Инфицирование КЭ 7 проводили в аллантоисную полость, используя 10-4 разведение инокулята. Генетическую стабильность вирусных конструкций определяли в обратной транскрипционной полимеразно-цепной реакции(ОТ-ПЦР),, К.Т.,,, (51)// . 2011. - . 476. .15-19 по размеру рекомбинантного гена 1 на 1, 3 и 5 пассажах в сравнении сплазмидами, кодирующими соответствующие гены. На этих же пассажных уровнях проводили секвенирование 1 генов рекомбинантных штаммов вируса гриппа А субтипов 51 и 11 методом Сенгера с использованием коммерческого набора 3.1. Одновременно определяли инфекционную и гемагглютинирующую активностьрекомбинантных штаммов. По результатам исследований установлено, что все рекомбинантные штаммы -1-124-7/1251, -1-124-16-5, -1-1247/12-11 и 124-16-11 вируса гриппа А субтипов 51 и 11 обладают достаточно хорошими репродуктивными свойствами в КЭ. Следует отметить, что в первоначальных пассажах в КЭ рекомбинантные штаммы имели низкие титры как инфекционной, так и гемагглютинирующей активности, однако с увеличением пассажных уровней указанные показатели возросли (таблица 1). К 5-му пассажному уровню титры инфекционной активности вирусов были в пределах от 7,950,22 до 9,20,14 ЭИД 50/мл. Исследование 1 гена в РТПЦР показало, что все рекомбинантные штаммы на протяжении 5 пассажей проявляют генетическую стабильность в КЭ (фиг.2 А). Размеры 1 генов 4 рекомбинантных штаммов,содержащих бруцеллезные белки 7/12 или Ор 16, в агарозном геле соответствовали размерамплазмид (1110 и 1242 пар оснований,соответственно). Подтверждением полученных результатов послужили данные секвенирования, согласно которым в 1 гене всех рекомбинантных 8 штаммов имеются нуклеотидные последовательности соответствующие бруцеллезным белкам 7/12 или Ор 16. Результаты вестерн блоттинга (фиг.2 В) показали,что в КЭ, инфицированных рекомбинантными штаммами идет правильная экспрессия фюжн белков 1-7/12 или 1-Ор 16 с молекулярной массой около 26 и 33 , соответственно. Аминокислотная последовательность рекомбинантных фюжн - белков 1-Ор 16 и 17/12 показана на фиг.3 А, В. Пример 3 Дизайн исследования консорциума рекомбинантных штаммов - 1-124-7/1251, -1-124-16-51, -1-1247/12-11 и -1-124-6- вируса гриппа А субтипов 51 и 11 на лабораторных животных. В исследованиях использованы 140 самок/ мышей в возрасте 6-8 недель (весом от 15 до 18 г, из, ) и 55 самок беспородных морских свинок, весом 300-350 г (Центр экспертизы лекарственных средств и изделий медицинского назначения, Алматы,Казахстан). Лабораторные мыши методом рандомизации были равномерно распределены на 10 групп девять опытные (126), вакцинированные моно и бивалентными рекомбинантными штаммами с использованием и.н. (42), к. (42) и п.к. (42) методов введения, и одна контрольная (14) негативная группа (ФБР). Морские свинки таким же способом были распределены на 11 групп девять опытные (45), двукратно вакцинированные моно и бивалентными рекомбинантными штаммами с использованием и.н. (15), к. (15) и п.к. (15) методов введения, одна контрольная (5) негативная (ФБР) и одна контрольная (5) позитивная (вакцинированные В.19) группы. В качестве критериев приемлемости рандомизации считали отсутствие внешних признаков заболеваний и гомогенность групп по весу тела (20). Животные на протяжении всего опыта содержались изолированно друг от друга и имели свободный доступ к воде и стандартному корму для грызунов. Мыши и морские свинки после легкой анестезии метаксилофураном (, ), с использованием им., к. и п.к. методов введения были двукратно с интервалом в 28 суток привиты рекомбинантными вирусами гриппа А субтипов 51 (прайм вакцинация) и 11 (бустерная вакцинация). Детальная схема иммунизации животных показана в таблице 2. Морских свинок из группы позитивного контроля иммунизировали однократно подкожно вакцинным аттенуированным штаммом В.19 в дозе 2109 КОЕ/мл. Мышам и морским свинкам из группы негативного контроля в качестве инокулята вводили ФБР. Для оценки безопасности вакцин животные (по 2 мыши) опытной и негативной контрольной групп на 5 сутки после каждой вакцинации (36) были умерщвлены методом цервикальной дислокации. У умерщвленных мышей,подвергнутых патологоанатомическому вскрытию, отбирались различные органы сердечнососудистой,дыхательной,пищеварительной,мочевыделительной и иммунной систем для гистологических исследований. На 28 сутки после одно и двукратной (по 5 мышей из каждой группы) вакцинации у мышей опытной и негативной контрольной групп, умерщвленных аналогичным образом, с соблюдением асептических условий были отобраны селезенки для определения уровня клеточного иммунитета ванализе, а также образцы крови для определения антител к бруцеллезным вставкам (7/12 и Ор 16) в ИФА. Для дифференциации вакцинированных животных от больных у морских свинок на 14, 28 сутки после каждой вакцинации, а также на 7, 14, 21, 28 сутки после контрольного заражения отбирались образцы крови для исследования в Роз-Бенгал пробе (РБП,Антиген, Казахстан), реакции агглютинации (РА,Микроген, Россия) и реакции связывания комплемента (РСК, Микроген), которые ставили в соответствии с инструкциями, прилагаемым к наборам. Пример 4 Испытание безопасности консорциума рекомбинантных штаммов -1-124-7/1251, -1-124-16-51, -1-1247/12-11 и -1-124-16-11 вируса гриппа А субтипов 51 и 11 на мышах Безопасность консорциума рекомбинантных штаммов -1-124-7/12-51, -1-12416-51, -1-124-7/12-11 и -1124-16-11 вируса гриппа А субтипов 51 и 11 или степень их аттенуации определяли на мышах в сравнении с группой негативного контроля(ФБР). Для этого за вакцинированными мышами вели ежедневное наблюдение. При этом безопасность оценивали на основе изучения выживаемости, общего состояния, поведения и динамики веса животных, а также на основе патологоанатомических и гистологических исследований. Выживаемость, общее состояние и поведение животных после иммунизации определяли в ходе 56-суточного клинического наблюдения. Взвешивание животных проводили на 0 и 1-14 сутки после каждого введения вакцин. По результатам исследований установлено, что ни в одной из групп мышей не отмечалось гибели животных на протяжении всего срока наблюдения. Общее состояние животных опытных и контрольной групп при визуальном осмотре (двигательная активность, аппетит и внешний вид) были одинаковыми. При анализе динамики массы мышей в течение 28 суток после одно и двукратной вакцинации вне зависимости от вида рекомбинантного штамма и способа введения отмечена положительная динамика роста массы тела животных (данные не показаны). Прирост массы тела мышей в опытных группах к концу срока наблюдения не отличался от показателей контрольной группы (4.7 г или 29.1) и составлял порядка 3.9-4.8 г (23.6-29.0). Патологоанатомические и гистологические исследования органов (сердце, легкие, печень,почки и селезенка) мышей на 5 сутки после одно и двукратной вакцинации не выявили каких-либо макро или микроскопических деструктивных изменений (данные не показаны). Полученные результаты показали,что испытанные моно и бивалентные рекомбинантные штаммы -1-124-7/12-51, -1-12416-51, -1-124-7/12-11 и -1 1-124-Ор 16-Н 11 при двукратной и.н., к. и п.к. иммунизации безопасны для мышей. Пример 5 Антительный ответ к бруцеллезным вставкам 7/12 и Ор 16 у мышей, иммунизированных консорциумом рекомбинантных штаммов -1124-7/12-51, -1-124-16-51, 1-124-7/12-11 и -1-124-16-11 вируса гриппа А субтипов 51 и 11. На 28 сутки после прайм и бустерной иммунизации у мышей из опытных и контрольной групп отбирали образцы крови для выявления антител к 7/12 и Ор 16 в ИФА. Результаты проведенных исследований (фиг.4) показали, что однократная иммунизация моно и бивалентными рекомбинантными штаммами -1-124-7/1251, -1-124-16-51 вне зависимости от способа введения не способствует формированию существенных титров антител к бруцеллезным вставкам. Лишь в группе животных иммунизированных к. способом бивалентными образцами рекомбинантных штаммов было отмечено накопление антител к 7/12 и Ор 16 в титре 52.710.7 и 40.06.4, соответственно. После бустерной вакцинации у мышей опытных групп, иммунизированных моно и бивалентными рекомбинантными штаммами -1-124-7/1211, 124-16-11, был отмечен многократный прирост среднегеометрических титров (СГТ) антител к белкам 7/12 (9.3-18.5 раза) и Ор 16 (1.5-3.6 раза) со всеми испытанными способами введения. Однако при этом наиболее существенное (Р 0.05-0.01) увеличение СГТ антител к бруцеллезным вставкам после бустерной вакцинации было отмечено в группах мышей,иммунизированных преимущественно к. способом. Следует отметить, что уровни СГТ антител к 7/12 и Ор 16, формируемых к бивалентным образцам рекомбинантных штаммов, несмотря более низкие иммунизирующие дозы (в 2 раза), нисколько не уступают своим моновалентным вариантам(Р 0,05), но даже несколько их превосходят. Таким образом, на основании полученных результатов было установлено, что моно и бивалентные образцы рекомбинантных штаммов 1-1 -124-7/12-51, -1 -124-165 51, -1-124-7/12-11 и -1-12416-11 с подтипами 51 и 11 в режиме прайм и бестерной иммунизации с использованием и.н., к. и п.к. способов введения способны формировать антитела к бруцеллезным белкам 7/12 (СГТ 242.5-735.0) и Ор 16 (СГТ 34.8-105.5) в ИФА. Пример 6 1 клеточный иммунный ответ, формируемый консорциумом рекомбинантных штаммов -1124-7/12-51, - 1-124-16-51, 1-124-7/12-11 и -1-124-Ор 16-Н 11 вируса гриппа А субтипов 51 и 11. Степень формирования бруцелла-специфичного клеточного иммунитета моно и бивалентными рекомбинантными штаммами -1-124-7/1251, - 1-124-16-5, -1-1247/12-11 и-1-124-16-11,экспрессирующими белки 7/12 или 16, в зависимости от способа введения определяли на мышах на 28 сутки после ревакцинации ванализе. В результате исследований (Фиг.5) было установлено, что моно и бивалентные образцы рекомбинантных штаммов в режиме двукратной вакцинации и вне зависимости от способа введения по сравнению с контрольной группойформируют ярко выраженный Т 1 клеточный иммунный ответ (Р 0,005-Р 0,001), о чем свидетельствует наличие большого количества- продуцирующих лимфоцитов в лунках (от 1129 до 65145 точек/4105 клеток). По сравнению с группой животных, вакцинированных вирусными конструкциями - 1-124-7/12 (5111) количество точек было существенно больше в группе мышей, вакцинированных рекомбинантными штаммами, кодирующими бруцеллезный белок Ор 16, в особенности при К. (Р 0,005-Р 0,001) и П.К. (Р 0,05-Р 0,025) способах введения. В пределах отдельных рекомбинантных штаммов,экспрессирующих белки 7/12 или Ор 16,количество точек в зависимости от способа введения не имели достоверной разницы (Р 0,05). Пример 7 Оценка протективности консорциума рекомбинантных штаммов -1-124-7/1251, -1-124-16-51, -1-1247/12-11 и -1-124-16-11 вируса гриппа А субтипов 51 и 11. На 28 сутки после бустерной вакцинации морские свинки опытной (45) и негативной контрольной (5) групп (ФБР) были заражены вирулентным штаммом В.544 подкожным способом в дозе 5102 колониеобразующих единиц(КОЕ)/животное. Контрольное заражение морских свинок из группы позитивного контроля (5) проводилось аналогичным способом на 56 сутки после однократной иммунизации вакцинным штаммом В.19. На 30 сутки после контрольного заражения все морские свинки были умерщвлены с помощью СО 2 асфиксии, вскрыты в асептических условиях для взятия следующих органов заглоточный, нижнешейный, правый паховый, левый паховый и парааортальный 6 лимфатические узлы, печень, почку, селезенку и костный мозг. Из изъятых органов делали посевы в пробирки со средой триптон-соевого агара (ТСА). Посевы инкубировали в термостате при температуре 37 С в течение 4 недель, в период которых периодически проводили учет роста бактериальных культур. Животное считалось заразившимся, если хотя бы из одного органа высевалась культура бруцелл. Результаты бактериологического исследования оценивали по количеству морских свинок, от которых не выделены культуры (процент не заразившихся животных или иммуногенность),по количеству культур на одну заразившуюся свинку и по интенсивности обсеменения(инфицированность) организма животных, которую вычисляли по следующей формуле где, х - индекс инфицированности (И.И.)- число выделенных культур в - число морских свинок в опыте с - число органов и лимфатических узлов, взятых для посева. Дополнительным показателем при оценке протективности служил параметр обсемененности селезенки у животных после контрольного заражения. Для этого, отобранные селезенки гомогенизировали в 2 мл 0,1 тритона в ФБР,делали 10-кратные разведения и высевали в ТСА,которые инкубировали 37 С в течение 14 суток. Результаты представляли в виде колониеобразующих единиц (КОЕ)стандартная ошибка (СО) на группу. Степень защиты животных(10 протективности) высчитывали путем отнятия значения 10 экспериментальной группы от такового значения контрольной группы. В результате проведенных исследований(таблица 3) было установлено, что в сравнении с контрольной группой (ФБР) все образцы вакцин по показателю И.И. и процента не заразившихся животных (вне зависимости от способа введения) в той или иной степени обеспечивают защиту морских свинок от заражения штаммом В.544. При этом наилучшая степень защиты среди опытных групп морских свинок были достигнуты в группах животных, вакцинированных К. способом моновалентными рекомбинантными штаммами,экспрессирующими белок Ор 16 (И.И. 6.2, защита 60), а также бивалентными рекомбинантными штаммами, экспрессирующими белки 7/12 и Ор 16 (И.И. 4.8, защита 60). В группе животных,вакцинированных В.19, показатель И.И. был самым минимальным (1,7), однако процент не заразившихся животных (60) был такой же, как и вышеуказанных опытных группах. Во всех отношениях самые низкие показатели протективности (И.И. 10.6-16.8, защита 0-40) были отмечены в группе животных, вакцинированных моновалентными рекомбинантными штаммами 1-124-7/12 (5111). В следующих сериях исследований протективность вакцин оценивали по степени высеваемости вирулентного штамма В.544 из селезенки животных. Результаты исследований показали (таблица 4), что все образцы вакцин, в том числе и моновалентные рекомбинантные штаммы- 1-124-7/12 (5111), показавшие наихудшие результаты по И.И. и проценту не заразившихся животных, вне зависимости от способа введения по сравнению с контрольной группой(ФБР) обеспечивают более чем значительную (Р 0.01-0.001) защиту морских свинок. При этом наилучшая степень защиты среди опытных групп морских свинок были также достигнуты в группах животных, вакцинированных К. способом моновалентными рекомбинантными штаммами, экспрессирующими белок 16 (10 протективности 3.78), а также бивалентными 16 рекомбинантными штаммами, экспрессирующими белки 7/12 и Ор 16 (10 протективности 3,90). Следует подчеркнуть,что по показателю высеваемости вышеуказанные рекомбинантные штаммы нисколько не уступают(Р 0.02) коммерческой вакцине В.19 (10 протективности 4.12). Пример 8 Дифференциация вакцинированных животных от инфицированных с помощью консорциума рекомбинантных штаммов -1-124-7/1251, -1-124-16-51, -1-1247/12-11 и -1-124-16-11 вируса гриппа А субтипов 51 и 11. Для этого у морских свинок на 7, 14, 21 и 28 сутки после каждой вакцинации, а также после контрольного заражения В.544 отбирались образцы крови для исследования в таких широко распространенных серологических скрининговых тестах как РБП, РА и РСК. Параллельно к этому в аналогичные сроки после вакцинации исследовались сыворотки крови морских свинок,привитых В.19. Результаты исследований показали, что у морских свинок привитых моно и бивалентными рекомбинантными штаммами в исследованные сроки после прайм и бустерной вакцинации не выявлялись антитела в РБП, РА и РСК. А в группе животных, привитых В.19,как и следовало ожидать антитела в РБП, РА и РСК появились на 7 и 28 сутки после вакцинации,соответственно (данные не показаны). После контрольного заражения (таблица 3) в группе животных, вакцинированных моно и бивалентными рекомбинантными штаммами антитела стали выявляться вначале в РБП(преимущественно) на 14 сутки, а к 28 суткам и в других реакциях. Однако при всем этом следует особо подчеркнуть, что у вакцинированных животных, отрицательно 17 реагировавших по результатам бактериологии (отсутствие бруцелл в исследованных лимфатических узлах и паренхиматозных органах), в течении всего срока после контрольного заражения не выявлялись антитела в РБП, РА и РСК. В то время как в группе животных, привитых В.19, которые также отрицательно реагировали по бактериологии,антитела в указанных реакциях стали выявляться уже с 7 суток после контрольного заражения. Таким образом, установлено, что иммунизация животных моно и бивалентными рекомбинантными штаммами -1-124-7/12-51, -1-12416-51, -1-124-7/12-11 и -1124-16-11 создает возможность не только эффективной дифференциации вакцинированных животных от инфицированных, но и дает возможность выявить поголовье больных бруцеллезом животных в вакцинированном стаде(группе). Консорциум рекомбинантных штаммов -1124-7/12-51, -1-124-16-51, 1-124-7/12-11, -1 -124-16-11 вируса гриппа А, семейства , рода, экепрессирующие бруцеллезные иммунодоминантные белки, предназначенные для получения противобруцеллезной вакцины. Таблица 1 Титры инфекционной и гемагглютинирующей активности вирусных конструкций при пассировании в КЭ Пассажный уровень/биологи ческая система 1/КЭ 3/КЭ 5/КЭ Схема иммунизации животных рекомбинантными вирусами гриппа А субтипов 51 и 11 Вид животного- 1-12416 Объем инокулята для мышей при И.Н., К., П.К. способах введения соответственно составлял 50, 25, 200,а для морских свинок при тех способах введения 100, 50, 200 , соответственно. Таблица 3 Протективность вакцин на модели морских свинок в зависимости от способа введения, оцениваемая по И.И. и проценту не заразившихся животных Вакци Спос Ном нация об ер введ жив ения отны х Бактериологические исследования органов животных Индек с пече почк сел костны инфиц нь а езе й мозг ирован ности нка заглот нижне прав левый пара очный шейны ый пахов аорт й пахо ый альн вый ый не Исследование сывороток крови в зара РБП, РСК и РА зив 7 14 21 сутки 28 сутки ших сутки сутк ся и жив отны х 28457 Вакци Спос Ном нация об ер введ жив ения отны х Бактериологические исследования органов животных Индек с пече почк сел костны инфиц нь а езе й мозг ирован ности нка заглот нижне прав левый пара очный шейны ый пахов аорт й пахо ый альн вый ый не Исследование сывороток крови в зара РБП, РСК и РА зив 7 14 21 сутки 28 сутки ших сутки сутк ся и жив отны х положительный результат (-) отрицательный результат положительно реагировало в РБП , в РСКи РА Таблица 4 Степень протективности вакцин, оцениваемая по высеваемости бруцелл из селезенки морских свинок,зараженных вирулентным штаммом В.544 Вакцина ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Консорциум рекомбинантных штаммов -1124-7/12-51 (62 реассортант вирусов гриппа/ /8/34 11 и ///6/05 51,депонирован в Коллекции микроорганизмов РГП НИИПББ КН МОН РК, под номером М-4-13/), 1-124-16-51 (62 реассортант вирусов гриппа///6/05 51, депонирован в Коллекции микроорганизмов РГП НИИПББ КН МОН РК, под номером М-5-13/), -1-124-7/12-11 (62 реассортант вирусов гриппа / /8/34 11 и/ /20/99 11, депонирован в Коллекции микроорганизмов РГП НИИПББ КН МОН РК, под номером М-6-13/ и -1-124-1611 (62 реассортант вирусов гриппа //8/34 11 и / /20/99 11,депонирован в Коллекции микроорганизмов РГП НИИПББ КН МОН РК, под номером М-7-13/ вируса гриппа А,семейства О,рода,экспрессирующие бруцеллезные иммунодоминантные белки, предназначенные для получения противобруцеллезной вакцины.