Способ получения лейкоцитарных интерферонов человека

Изобретение относится к области технологии рекомбинантньж ДНК, тДе.П р и м е р. Используют два микроорганизма Е.со 11 х 1776 и Е.го 11 К- 2 штамм 294 (конец А.сЬ 1 лет,Ъзтш) .МРНК лейкоцитарного интерферона человека (Ъе 1 Г) получают из лейкоцитов человека, взятых у-больных хронической миелогенной лейкемией. Таковыми являются линия клеток, обозначенная КС-1, полученных от пациентов с острой миелогенной лейкемией.У КС-1 клеток индуцируют продукцию лейкоцитарного интерферона мРНК с помощью вирусов Сендай или Ньюкастла. Клетки собирают 5 ч спустя после индуцирования и РНК приготовляют по методике с применением гуанидинтиоцианат-гуанидингидрохлорида.Для получения 12 5 фракций полн (А)1 МРНК используют олигодеокситимидин . д Т-целлюлозную хроматографию и сахарозное градиентное ультрацентрифугирование.5 мкг мРНК используют для получения двойной цепочки КДНК по цепочечной методике. Указанные КДНК фракционируют по размерам с помощью электрофореза на 6-ном полиакриламидном геле и 230 нг материала с разме рами в интервале от 500 до 1500 в.п. выделяют электроэлюированием. 100 нг этой КДНК присоединяют к деоксицити диновым остаткам (ос) и реденатури руют с д 70 нг плазмид рН К 322, которые были соединены с деоксигуанозиновыми (ас) остатками по (Ре 1) сайту и используют для трансформации Е.со 11 х 1776. Получают устойчивые к тетрациклину, чувствительные к ампициллину траисформанты. Синтезируют четыре набора дезоксиолигонуклеотидных зондов для каждой последовательности,содержащие три (Т 1 А В, С, В) или один (Т-13 А В, С, В) олигонуклеотид каждая.мРНК получают из 12 5 гнк, кс-х иидуцированньж вирусом Сендай либо целиком полн (А) мРНКиз неиндуци рованных лейкоцитов. Р-меченные КПНК готовят известным способом. Немеченньт продукт вьщеляют с помощью ГЕЗЛЬфИЛЬТРЗЦХШ на УЛОНКЕ, ЗЗПОЛНЕН ной 10 мл Сефадекс С-50, обработан чной 0,3 М ПаОН в течение 30 мин при 7 ОС для разрушения РНК, нейтрализуют НС 1 и осуществляют гибридизацию.Для идентификации клонов рЬ 1 рЬ 3 О используют быстрый процесс изолирования плазмиды по Бирнбойму.При этом получают 1 мкг плазмиды ДНК из каждых 500 индивидуальных трансформантов Е.со 11 К-12 штамма 294. Каждый образец ДНК денатурируют и наносят на нитроцеллюлоэные фильтры в трех экземплярах, следуя методике Кафатоса с сотр. (см. вы уше).Три группы нитроцеллюлозных фильтров, содержащих 500 образцов плазмид гибридиэируют со стимулированной кДНК заложенной с Т-1 группой носителей информации (праймеров) Т-13, заложенной стимулированной КДНК, нестимулированной кДНК,приготовленной с использованием обеих групп носителей информации.Клоны считают положительньши если они гибридизируют сильнее один или оба зонда стимулированной кЛНК чем полностью нестимулированный зонд. Было отобрано 30 положительных клонов (рЬ 1-рЬ 30) из 500 для дальнейшего анализа.Трансформанты Е.со 11 к 1776 скри днируют по методике гибридизации ко лоний, используя в качестве зонда Э 1 Р-меченную стимулированную МРНК. Немеченную МРНК из нестимулированньш клеток смешивают с зондом при соотношении 2 О 01 для конкуренции с нестимулированной МРНК, имеющейся вР-меченном препарате. Гибридизация меченой МРНК будет происходить предпочтительно в колониях, содержащих г стимулированные последовательности. Получают три класса трансформантов 2-3 колоний, гибридизованных 2 РмРНК очень сильно 10 гибридизованных значительно меньше, чем 1-й класс остальное, не дающее определимы сигнал гибридизации..рон-специфических последовательнос тей с помощью анализа, которьй зависит от гибридизации интерфероновсй змнду ДБК Первоначально вьшашивают индивидуально 60 сильно положительных колонвпт(100 мкг/мл), тнмидином (20 мкг/мл),и 6 биотнном (1 мкг/мл). Среда М 9 содержит 6 г/л Ыа 1 НРО 4 3 г/л КН 1 РОд 0,5 г ЫаС 1 и 1 гЛ 1 ЫНЦ. После автоклавирования прибавляют 1 мл стерильного 1 М М 3504 и 10 мл стерильного 0,01 Н СаС 1,. Собирают 10 культур и изолируют плазмиду ДНК из шести пулов, как описано Клевеллом с сотр. Втоспешйзсгу 9, Ь 28-А 40 (1970). 10 мкг каждого пула плазмиды ДНК расщепляют Н 1 по 111 денатурируют и ковалентно связывают с ДБМ (диаэобензилоксиметиловой) бумагой. На каждом фильтре гибридизуют 1 мкг очищенной мРНК из стимулированных кле.ток. Негибридизованную мРНК удаляют промывкой. Специфически гибридизованную мРНК элюируют и транслируют в социты личинок Хепорпа.По этой пробе все 6 пулов были отрицательныи. 5 пулов из 10 колоний каждый и 1 пул на 9 колоний делают из 59 слабо положительных колоний (класс 2). Готовят плаэмиды из пулов и исследуют, как описано вые. Среды 6 тестированных пулов был тестирован один (к 1 О), гибридизованныйв интерферонную мРНК при условии значительно выые исходных уровней каждого времени. Для того, чтобы определить специфический интерферонный кДНКклон готовят плазммдш ДНК из 9 колоний пула К 10 и исследуют индивидуально. две из девяти плазмид (101 и Ш 104) связывают индтерферонную мРНК существенно лучше,чем при указанным исходных уровнях. Из плазмиды Ю 104 выделяют один В 31 11 рестрикционный фрагмент, содержащий 260 в.р. меченный э 1 Р с использованием процедуры, описанной Тейлором с сотр.,1 тиспольэуютв каче-стве зонда для независимого скрининга 400 Е.со 11 294 трансформантов с помощьюпроцедуры скрининга колоний д 1 п вйси.Идентифицируют 9 колоний (рЬ 31 рЬ 39), которые гибридизуют до различной степени с этим зондом.Кроме того, используют меченный 260 Евро Фрагмент для независимого скрининга 4000 Е.со 11 294 трансформантов таким же образом. Индентифитцируют 50 колоний, которые гибриднЗУЮТ ДО ВЗЗПНЧНЗЙ СТЭПЭПИ С ЭТИКИ ЗОН дом, Одна содержит Ъе 1 Р С-фрагмент,одна - Ье 1 Р Нфрагмент н одна - фраг 2875похожий на Ье 1 Р Н. Полученные гибрид ные плазмиды обозначают рЪЕ 1 Г Н и т.п. . Готовят плазмиду ДНК из всех 39 потенциальных Ье 1 Р кДНК клонов и проводят повторный скрннинг с тем же260 в.р. ДНК зондом, используя процедуру гибридизации Кафатоса с сотр.(см. выше). Три плазмиды (ръ Ь, р.31, ръ 34) дают очень сильные признаки(ръ 13, рь 30, рь 32, рЪ 36) гибридизованы умеренно и три (ръ 6, рЬ 8,ръ 14) слабо гибридизованы зондом. Также скринируют 39 потенциальных Ье 1 Р кДНК рекомбинантных плазмид с использованием Р-меченных синтетических ундекамеров (индивидуальные Т-1 первичные пулы праймеров информации или индивидуальные Т-13 праймеры информации) непосредственно в качестве гибридизующих зондов. Условия гибридизации выбирают таким образом,что для определимых сигналов гибридизации должны требоваться точно спаренные основания. Следовательно,плаэмда ДНК из 3 клонов была приготовлена по стандартной процедуре очищения ливата (Клевелл с сотр.,см. вые) и очищена колонной хроматографией на Биорад Агарозе А-50. Образцы по 3 мкг каждого препарата делают линейным обработкой Есо К 1 денатурируют в щелочи и наносят на 2 отдельным нитроцеллюлозных филь тра по 1,5 мкг на пятно (Кафатос с п сотр., см. выше). Фосфорилируют индивидуальные синтетические деоксиолигонуклеотидные праймеры информации и пулы праймеров информации с помощью(Х 37 р) АТР, (2500 Кю/ммоль) объеди няют в 30 мкл 50 мМ трисНС 1 10 мМ М 3 С 11 15 мМ -меркаптоэтанола. Добавляют 2 ед. Т 4 полинуклеотидкиназы и после 30 мин ври 3300, 31 Р-меченные праймеры информации очищают хроматогафией в колонках с 10 мл Сефадекс С-50. Гибридизации осуществляют сиспользованием 106 срм пула праймеров Т-13 С или 3-106 срм пула прайме ра Т-1 С при 15 оС в течение 14 ч внилпиролидона 0,2 фиколла). Фильтры промывают 5 мии (3 раза) при 0 С бх ЗЗС, сушат и облучают на рентгеновской пленке. При этом плаэмида ДНК из клонас пулом праймеров информации Т-1 С и праймеров информации Т-13 С но не да ет определимой гибридизации с други ми ундекамерами. Несколько из 39 потенциальных Ье 1 Г плазмид (ръ 2 А,13, 172 О 30,313 д) также гибридизуют собоими этими зондами. Рас 1-усвоение ръ 31 показывает размер кДНКвставки который должен составлять примерно 1000 в.р. Найдено, что первьйАТС-транслирующий начальньй кодон состоит из 60 нуклеотидов от 5 конца последовательности и затем 188 кодонов после ТСА концевого триплета, имеется 342 нетранслируемых нуклеотидов у 3 конца, следующих на поли-(А)-последовательностью. Путативный сигнальны пептид (по-видимому, включенный в секрецию готового Ъе 1 Е из лейкоцитов) имеет длину из 23 аминокислот. 165 аминокислот, составляющих готовый Ъе 1 Б имеют рассчитанный молекулярны вес 19390, Ье 1 Г закодированны ръ 31 обозначают Ье 1 Р А. ЗАП ЗА рестрикционньй эндонуклеазньй участок расположен между кодонамм 1 и 3 соРА. Два синтетических деоксиолигонуклеотида включают АТС-транслирующий начальный кодон реконструируют кодов аминокислоты 1 (цистеин) и создают Есо Ц 1 липкий конец. Эти олигомеры были связаны в 34 в.р. ЗАП За-А-а 11 фрагмент рЬ 31. Полученный в результате 45 вДр. продукт лигируют в два дополнительных фрагмента ДНК для конструирования 86,5 в.р. синтетического(натурального гибридного гена, которы кодирует ЬШР А и который связывается Есо К 1 и Рас 1 (рестрикционнымн участками). Такой ген включают в. рп К 322 между Есо К 1 и Рас 1 участками для получения плазмиды РЪ 1 Р А 1. Конструкция триптофанового контрольного элемента, содержащего Е.со 11 сгр промотор, оператор и гр лидер рибосомсвязывающего участка,но не содержащего АТС-последовательности для инициирования трансляции. Плазмида рСМ 1 несет триптофановый оперон Е.со 11, содержащий делецию АЬ Е 1 д 13 Н экспрессирует протеин, включающий первые 6 аминокислот стр лидера и приблизительно последний третий сгр Е полипептнд (позже упоминаемый в сочетании как ЪЕ), а также стр В полипептид в его целостид все под контролем системы стр промотор-оператор. Плазмиду (20 мкг) обрабатывают рестрикционным ферментом РЧ 0 11, который расщепляет плазмиду на пять участков. Генные фрагменты затем комбинируют с линкерами Есо ЕЕ, состоящими из самокомплиментарного олигонуклеотида с последовательностью рСАТСААТТСАТС обеспечи вая Есо К 1-участок расщепления для последующего клонирования в плазмидусодержащую Есо К 1-участок. Обрабатывают 20 мкг ДНК-фрагментов, полученных из рСМ 1, 10 ед. Т 4 Дик-лигаэы в присутствии 200 пкмоль 5 -фосфорилированного синтетического олигонуклеотида рСАТСААТТСАТС и в 20 мклТ 4 ДНК-лигаэного буфера (20 мМ трио,рН 7,6, 0,5 ММ АТФ, 10 мМ МрС 12 5 ми дитиотрейтола)при 4 С в течение ночи. Затем раствор нагревают 10 мин при 70 С до прекращения лигации. Связки отщепляют перевариванием Есо К 1 и фрагменты, теперь с концами Есо К 1,отделяют, используя электрофорез на 52-ном полиакриламидном геле (ПАГЭ),и при наиболее широких фрагментах,выделенных из геля первым пятном с этидиумбромидом, локализуя фрагмен ТЫ УЛЬТРЗФИОЛЕТОВЬМ светом, И выре зают из геля интересующие участки. Помещают каждый гелевый фрагментс 300 мкл 0,1 х ТБЕ в диализаторный бачок и подвергают электрофорезу при 100 В в течение часа в 01 ХТБЕ-буфере(ТБЕ-буфер содержит 10,8 г трис-ос. нования 5,5 г борной кислоты, 0,09 г Ыа 1 - ЭДАТУК в 1 л воды). Водный раствор собирают из диалшзаторс ного бачка, экстрагируют фенолом,экстрагируют хлороформом, делают 0,2 М раствор хлористого натрия и извлекают ДНК в воде после осаждения этанолом, содержащий ген стр промотор-оператор с липкии концами Есо К 1 идентифицируют по указанной ние проЦедуре,кот 0 рая вызывает вставление фрагментов в чувствитель НУЮ К тетрациклину П 1 Е 1 З 1 Ч 3 Ду КОТОРЭЯПлазмида рВЦН 1 экспрессирует ам- пицилпиновую устойчивость и содер жит ген устойчивости к тетрациклину. Следовательно плазмнда чувствительна к тетрацнклину. Плазмиду делают устойчивой к тетрациклину путем введения системы промотор-оператор в участок ЕсоК 1.рВКНШ расщепляют ЕсоК 1 и удаляют фермент экстракцией фенолом с последующей экстракцней хлороформом и собирают в воде после осаждения этанолом. Полученную в результате молекулу ДНК в отдельных реакционных смесях объединяют с кажды из трех фрагментов ДНК, полученных выше, и лигируют с Т 4 ДНК-лигазой, как описано выше. Используют ДНК, находящуюся в реакционной смесп, Для трансформации Е.со 15 К-12 штамма 294 по стандартной методике и бактерии помещают на ЬВ(Ьцг 1 а-ВегЬап 1)-пластины, содержащие 20 мкг/л ампициллина-и 5 мкг/л тетрациклина. Отбирают несколько устойчивых к тетрациклину колоний, изолируют плазмиду ДНК и доказывают наличие жедаемого фрагмента с помощью рестрик ционного ферментного анализа Полу ченную плазмиду обозначают рв КН стр.Продукт расщепления с помощью Есо В 1 и Вам Н 1 вирусного генома гепатита В получают традиционным способом и клонируют в Есо К 1 и Ваш Н 1 участки ппазмнды р С Н 6 для образования плаэмиды рН 5 32. Затем ч расщепляют плазмиду рН 3 32 с помощью ХЪа.1 экстрагируют фенолом, хлоро формом осаждают этанолом и обраба тывают мкл Е.со 11 ДНК-полимерааой(50 мМ фосфата калия рН 7 Ь мм МЗС 12 1 ЬФ 1 В-меркаптоэтанола) содержащего 0,1 ММ а ТТР и 0,1 ММ, а СТР, в течение 30 мин при 0 С, затем 2 ч при 37 С. Такая обработка приводит к заполнению 2 из 4 нуклеотидов, комплементарных к выступающему вперед 5 концу Х Ьа 1 участка расщепления, 5 СТАСА 5 м СТАСА 3 т з тстДва нуклеотида, НС и НТ, были включены и дали конец с двумя выступающими вперед 5 нуклеотидами. Такой линейный остаток плазмиды рН 5 32(после экстракции фенолом и хлороформомъасбора в воде после осаждения этанолом) расщепляют Есо В 1, отделяют широкий плазмидньй фрагмент от меньшего Есо П 1-ХЪа 1-фрагмента с по 2875К 1-Тая 1-фрагментом триптофанового оперона (001 мкг),-происходящего из рВ КН стр. В способе легирования фрагмента из рП 5 32 к фрагменту Есо 11-Та 1, как описано выше,выступающий вперед Таз 1 конец связан с выступающим вперед концомХ Ьа 1, хотя он не совершенно спа реи основанию Уатсона-Крика-АСС ТСТ -АССТСТ Часть этой лигационной реакционной смеси трансформируют в клетки Е.со 11 294, проводят термообработку и помещают на пластины ЪВ содержащие ампициллин. Отбирают 24 колонии, выра щивают в 3 мл ЪВ (Луриа-Бертани)среды и изолируют плазмиду. Найдено,что 6 из них иеют ХЬа 1-участокре ренернрованньй с помощью Е.со 11, ка тализированной ДНК повторньм спариванием и репликацией- ТСТАСА - - ТСТАСА АССТСТ - - АСАТСТ Найдено, чтоэти плаэмиды расЩепляются как Есо К 1, так и Нра 1 ди дают ожидаемые рестрикционные фрагменты, Однуплазмиду обозначенную рТгр 14 используют для экспрессии гетерологических полипептидов. Плазмида рПСН 107 содержит генчеловеческого гормона роста (ЧГР)составленный из 23 аминокислотных кодонов полученных из синтетических ДНК-фрагментов, и 163 аминокислотных кодонов полученных из комплементарной ЦНК полученной с помощью обратной транскрипции информационной РНК ЧГР. Этот.ген, хотя в нем отсутствуют кодоны рге последовательности ЧГР, содержит АТС-транслирующий начальный кодон. Этот ген изолируют из 10 мкг рНСН 107 после обработки Есо К 1 с последующей обработкой Е.со 11 ДНК полимеразой Кленоза фрагмента иН ТТР и д АТР как указано выше. Пос ле экстракцни фенолом и хлороформом н осаждения этанолом плазмнду обрабатывают Ват НЕ.Фрагмент, содержащий ген ЧГР изолируют с помощью ПАГЭ с последующим электроэлюированнем. Полученный в результате ДНК-фрагмент также содержит