Способ идентификации сортов и форм картофеля на основе использования микросателлитных маркеров

МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Изобретение может быть использовано в селекции и семеноводстве картофеля. Задача изобретения - идентификация генотипов картофеля микросателлитными маркерами для молекулярно-генетической паспортизации сортов и форм. Технический результат может быть достигнут при использовании микросателлитных маркеров 0031, 1052, 1106, 0025, 0004,0012, 0032, 0033, выявить полиморфизм ДНК у образцов картофеля. Достижения технического результата позволит создать молекулярно-генетические паспорта сортов и форм картофеля и повысить эффективность сортовой идентификации в селекции, связанных с созданием новых сортов и размножением элитных семян в семеноводстве картофеля. На основе технических результатов представлены распределения восьми полиморфных-маркеров у сортов и форм картофеля казахстанской и зарубежной селекции, а также аллельные формулы сортов, представляющие индивидуальные молекулярно-генетические паспорта каждого сорта.(72) Какимжанова Алмагуль Апсаламовна Есимсеитова Асель Кайратовна Ахметоллаев Ильяс Амирханович Раманкулов Ерлан Мирхайдарович(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Национальный центр биотехнологии Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ СОРТОВ И ФОРМ КАРТОФЕЛЯ НА ОСНОВЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ МАРКЕРОВ(57) Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к молекулярно-генетическим исследованиям и представляет собой новый способ сортовой идентификации сортов и форм картофеля, контроля сортовой однородности картофеля с использованием метода полимеразной цепной реакции и микросателлитныхмаркеров. Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к молекулярногенетическим исследованиям и представляет собой новый способ сортовой идентификации сортов и форм картофеля, контроля сортовой однородности картофеля с использованием метода полимеразной цепной реакции и микросателлитныхмаркеров. Изобретение может быть использовано в селекции и семеноводстве картофеля. В последние годы проблема идентификации видов и сортов растений становится все более актуальной в связи с ускорением селекционного процесса и появлением большого числа новых форм. Особое внимание уделяется разработке эффективных методов паспортизации генотипов растений для использования в сортоиспытании,селекции, семеноводстве и контроле семенного материала. Одним из главных методологических подходов в изучении генетического полиморфизма растений является применение молекулярных маркеров. Эти маркеры позволяют различать виды и подвиды растений, а также давать количественную характеристику их генетического и аллельного разнообразия. С введением молекулярных маркеров в практику биологических исследований появились новые возможности детального изучения структуры и организации генома растений и количественной оценки степени сходства/различия на меж- и внутривидовом уровне. Для селекции растений особое значение имеет использование молекулярных маркеров для различения и идентификации сортов культурных растений, а также контроля за переносом генетического материала от дикорастущих сородичей при отдаленных скрещиваниях. Существует необходимость в разработке простых в исполнении,надежных при воспроизведении,высокоинформативных,сравнительно недорогих методов ДНК-технологий,которые позволяли бы генотипировать сорта растений, выявлять полиморфизм на уровне ДНК,паспортизовать сорта и формы и для решения многих других проблем. Для этого необходимо выбрать информативный вид молекулярных маркеров, унифицировать методы выделения и амплификации ДНК, позволяющие даже при минимальном обеспечении лабораторий проводить работы по паспортизации селекционного материала,по установлению индивидуальных характеристик,выявлению чистоты сортов,закреплению селекционных достижений и для решения других практических задач. Микросателлитные последовательности ДНК являются наиболее доступными,простыми,удобными и относительно недорогими маркерами,пригодными, прежде всего, для идентификации генотипов растений. Их преимущество кодоминантное наследование - позволяет различать гомо- и гетерозиготные растения. Использование-маркеров для генотипирования основано на высокой информативности данного метода. Высокий уровень полиморфизма микросателлитов,2 относительно равномерное их распределение в эухроматиновой части геномов и широкая представленность сделали их чрезвычайно популярными. Гипервариабельные микросателлиты представляют собой универсальную систему генетических маркеров для анализа наследуемых изменений на уровне ядерной ДНК и широко используются в исследованиях генетического полиморфизма популяций растений. Известен способ молекулярного маркирования и идентификации сортов и линий сахарного тростника с использованием микросателлитных маркеров, которые позволили идентифицировать с высокой точностью разновидности и линии растений сахарного тростника (Патент А 1/2010/004425 от 7.07.2010 г., номер публикаций О 2011004594 А 1). Недостатком этого данного способа является, геном специфичность предлагаемых праймеров, использование которых возможно только на сахарном тростнике. Известен способ идентификации пальмы микросателлитными праймерами. Генетические маркеры амплифицированы с помощью праймеров,из которого в дальнейшем получены дополнительные праймеры, для генетического анализа. Праймеры, генетические маркеры и методы генетического анализа могут быть использованы для отбора и селекции растений пальмы, имеющие качественные и количественные признаки, такие как размер, количество семян, содержание масла в семенах, качество масла, устойчивость к болезням,засухои солеустойчивость/2011/001496 от 18.11.2011 г., номер публикаций О 2012065228 А 1). Известен способ идентификации сортов сои на основе микросателлитных маркеров,включающий отбор пробы семян, их проращивание,выделение ДНК, отбор и синтез праймеров для полимеразной цепной реакции,проведение амплификации ДНК -праймером, разделение продуктов амплификации на фракции методом электрофореза в разделяющем геле, визуализацию продуктов амплификации (Патент 2388828 от 10.05.2010 г. Способ идентификации сортов сои на основе микросателлитныхмаркеров). Недостатками известных способов является геном специфичность (пальма, соя) предлагаемых праймеров и, следовательно, их непригодность для сортовой идентификации картофеля, а также отсутствие праймеров для идентификации и паспортизации сортов картофеля, невозможность создания генетического паспорта. Аналог изобретения. Нами не найдено идентичного способа идентификации сортов и форм картофеля с использованием молекулярногенетических -маркеров. Наиболее близким к предлагаемому способу определения сортовой принадлежности картофеля найдены следующие способы Набор и способ сортовой идентификации картофеля российской селекции при использовании трех ДНК маркеров 005, 12, 104. Для 32 сортов картофеля российской селекции составлены молекулярно-генетические паспорта на основе трех пар полиморфных микросателлитных маркеров (005/005, 12/12,104/104), соответствующие локусам(005, 12, 104), по которым определяют сорт картофеля. Недостатком этого способа является возможность его использования только для идентификации сортов картофеля российской селекции и использованы другие микросателлитные праймеры (Патент 2413774 от 10.03.2011 г. Биологический ДНК маркер для определения сортов картофеля, набор и способ сортовой идентификации картофеля). Задача изобретения - идентификация генотипов картофеля микросателлитными маркерами для молекулярно-генетической паспортизации сортов и форм. Технический результат может быть достигнут при использовании микросателлитных маркеров 0031, 1052, 1106, 0025, 0004,0012, 0032, 0033, выявить полиморфизм ДНК у образцов картофеля. Достижения технического результата позволит создать молекулярно-генетические паспорта сортов и форм картофеля и повысить эффективность сортовой идентификации в селекции, связанных с созданием новых сортов и размножением элитных семян в семеноводстве картофеля. На основе технических результатов в таблице представлены распределения восьми полиморфных-маркеров у сортов и форм картофеля казахстанской и зарубежной селекции, а также аллельные формулы сортов, представляющие индивидуальные молекулярно-генетические паспорта каждого сорта (таблица 1). Таблица 1 ДНК - паспорт 49 сортов картофеля казахстанской и зарубежной селекции Астана Альянс Мошняковский Когалы Алая Заря Шагалалы Жанайсан Кокчетавский ранний Мирас Никитка Тохтар Фирменный Нэрли Орбита Тамыр Тандем Улан Шортандинский Ягодный 19 К 4-7 Казахстанский Дуняша Бирлик Жуалы Аксор Ушконыр Тохтар 30 КФ Ауыл Кустанайские новости Акколь Аладин Латона Розара Невский Ресурс Лорх АВ АВН ВН ВН ВН В С АВ ВС ВС ВС ВС В ВС ВС ВС ВС С ВС ВС ВС ВС ВС ВС ВС ВС С ВС АВ ВС ВС АВ ВС ВС Елизавета Брянский ранний Жуковский ранний Журавинка Вектар Янка Лад Зорачка Уладар Лилея Бриз Скарб Манифест Результат приведенный в таблице 1, достигается тем, что полиморфные микросателлитные маркеры разработанные и описанныеМ. ( М.., 2009), определяют сортовую принадлежность наиболее распространенных и хозяйственно 0032 ВС ВС ВС С АС значимых сортов картофеля казахстанской и зарубежной селекции и представляют собой специфическую нуклеотидную последовательность Последовательность праймеров для микросателлитного анализа сортов и селекционных клонов картофеля Название праймеров Олигонуклеотидная последовательность праймерови Результат достигается тем, что используют восемь микросателлитных праймеров 0031,1052, 1106, 0025, 0004, 0012,0032, 0033, при подготовке реакционной смеси, состоящую из 30 мкл 10 хбуфер - 3,0 мкл смесь 4(10 ) - 2,4 мкл 2(5 ед/мкл) - 0,4 мкл ДНК (10 нг/мкл) - 3,0 мкл. В способе идентификация сортов и форм картофеля используют выделение ДНК из ростков глазков клубней и пробирочных растений картофеля, анализ геномной ДНК картофеля проводят с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). 4 ПЦР анализ проводят с использованием восьми микросателлитных маркеров,получают полиморфные аллели разного размера,визуализировали эти аллели ДНК с помощью электрофореза в агарозном и полиакриламидном геле, для идентификации выявленных аллелей у анализируемых сортов картофеля проводят сравнение генетического разнообразия. Сортовую принадлежность определяют по отсутствию или присутствию в анализируемых образцах определенных сортоспецифических аллельных фенотипов. Размер амплифицируемых продуктов определяют с помощью маркера молекулярных масс(25-700) и маркеров, синтезируемые в лаборатории органического синтеза НЦБ. Результат способа идентификации сортов и форм картофеля на основе использования микросателлитных маркеров достигается тем, что для каждого сорта и формы картофеля составляют молекулярно-генетический паспорт,который представлен в таблице 1, где показано,распределение выявленных с помощью восемь пар праймеров 0031, 1052, 1106, 0025,0004, 0012, 0032, 0033 полиморфные микросателлитные аллели. Таким образом,молекулярно-генетическая идентификация сортов и форм картофеля казахстанской и зарубежной селекции осуществляется с использованием микросателлитных маркеров, при проведении ПЦР анализа определяют сортоспецифичные маркеры для паспортизации генотипов. Посредством предлагаемого способа создают молекулярногенетические паспорта сортов и форм картофеля,определяют принадлежность сорта при использовании сортоспецифичных -маркеров. На завершающем этапе для каждого сорта составляют молекулярно-генетический паспорт с указанием распределения выявленных аллелей по восьми микросателлитным локусам. Методика использования изобретения 1. Выделение ДНК сортов и форм картофеля Для выделения ДНК использовали ростки глазков клубней картофеля, полученные путем проращивания в течение 21 суток в фактеростатной комнате и пробирочные растения, введенные в культуру. Выделение ДНК проводили по методике ( .К., 1991). 2. Полимеразная цепная реакция Выделенную ДНК использовали в качестве матрицы в реакции амплификации. Амплификацию ДНК проводили -маркерами в объеме реакционной смеси 30 мкл состава 10 хбуфер 3,0 мкл смесь 4(10 М) - 2,4 мкл 2(25 ) - 3,0 мкл прямой и обратныйпраймер (10 рМ) по 2,0 мклДНК полимераза (5 ед/мкл)- 0,4 мкл ДНК (10 нг/мкл) - 3,0 мкл. Использовали следующий режим амплификации 1) предварительная денатурация при 94 С в течение 5 мин следующие 30 циклов 30 с - денатурация при 94 С 30 с - отжиг в зависимости от праймера(0031 - 50 С, 1052 - 53 С, 1106 - 55 С,0025 - 55 С, 0004 - 60 С, 0012 - 55 С,0032 - 60 С, 0033 - 60 С) 30 с синтез при 72 С конечная элонгация при 72 С в течении 5 мин. Амплификацию ДНК проводили в амплификаторе. 3. Электрофоретическое разделение продуктов и визуализация ПЦР-продуктов Разделение немеченых продуктов амплификации, полученных с праймерами к последовательностям, проводили в 8 и 12 полиакриламидном геле при использовании камеры для вертикального электрофореза. Электрофорез вели при мощности 10 (220 вольт, 43 мА) в течение 20-24 часов. Каждый амплифицированный фрагмент ДНК в полиакриламидном геле рассматривался как индивидуальный дескриптор с определенной молекулярной массой, при использовании маркера молекулярной массы 25-700 и маркеры,синтезируемые в лаборатории органического синтеза НЦБ. Гель окрашивали в растворе бромистого этидия,затем электрофореграммы фотографировали в УФсвете с использованием аппарата. 4. Статистическая обработка результатов и составление молекулярно-генетического паспорта При использовании -праймеров полученные данные об аллельном составе у сортов и селекционных клонов картофеля заносили в таблицу в виде электронной базы в форматедля каждого генотипа, и для всех праймеров было указано присутствие (1) или отсутствие (0) каждого амплифицированного фрагмента ДНК. Построена матрица для расчета генетических расстояний помежду сравниваемыми генотипами картофеля ( М. 1973). Для построения дендрограммы использовали алгоритми компьютерную программу . Индекс информативности маркероврассчитывали по формуле (1) 1 где Р - частотапаттерна для локусаи суммирование распространяется напаттернов Эффективное число аллелей (Ае) рассчитывали по формуле (2)- гетерозиготность в локусе В качестве объектов исследований использовали 49 генотипов картофеля, районированных в Казахстане, из них 28 сортов казахстанской селекции Фирменный, Кокчетавский ранний,Шагалалы, Мошняковский, Акколь, Казахстанский,Ягодный 19,Астана,Мирас,Жуалы,Шортандинский, Когалы, Бирлик, Никитка, Аксор,Нэрли, Орбита, Тамыр, Тандем, Тохтар, Жанайсан,Альянс, Улан, Ауыл, Ушконыр, Алая Заря, Дуняша,Костанайские новости 3 сорта зарубежной селекции Розара (Германия), Аладин (Голландия),Латона (Голландия) 6 сортов российской селекции Елизавета, Лорх, Ресурс, Невский, Жуковский ранний, Брянский ранний 10 сортов белорусской селекции Зорачка, Лад, Лилея, Бриз, Манифест,Янка, Скарб, Вектар, Журавинка, Уладар и 2 линии картофеля, полученные методами биотехнологии в лаборатории биотехнологии и селекции растений НЦБ линия Тохтар с 30 КФ гриба,линия К 4-7. Эти сорта картофеля могут служить обучающейся выборкой для которых известно генетическое разнообразие и сортоспецифичные аллели и представлены в таблице 3. 5 Таблица 3 Оценка полиморфизма микросателлитных локусов у 49 сортов и селекционных клонов картофеля 3 (001)7 (0031)8 (1104)9 (1052)10(1106)12 (5121)17 (0025)20 (0004)21 (0012)22 (0014)24 (0032)25 (0033) Итого Среднее на локус Примеры выполнения предлагаемого способа Пример 1. Способ идентификации сортов и форм картофеля с помощью микросателлитного праймера 0025. Из ростков глазков клубней и пробирочных растений выделяют ДНК способом, указанным выше. На каждой из выделенных ДНК осуществляют ПЦР с праймером 0025. Полученный ПЦР-продукт амплификации визуализируют путем электрофореза в полиакриламидном геле, а после окрашивают бромистым этидием и электрофореграммы фотографируют в УФ-свете, идентифицируют Эффективное Индекс число информативности аллелей, (Ае) маркеров 0,91 0,190 3,16 0,643 4,03 0,750 2,04 0,532 3,75 0,730 1,63 0,145 2,55 0,531 2,67 0,641 3,03 0,610 2,18 0,673 1,68 0,412 2,07 0,501 2,48 0,530 Число редких аллелей 4 1 4 1 3 1 1 2 17 маркерные аллели различной длины,представляющие аллельные формулы сортов картофеля. На фиг.1, представлены полиморфные аллели для каждого сорта картофеля. Каждый из сортов характеризовался определенным сочетанием аллелей (таблица 4). Это распределение послужит эталоном при сравнении и идентификации растений неизвестных сортов картофеля. Путем сравнения распределения полиморфных ДНК разной длины среди исследуемых и эталонных сортов определяют сортовую принадлежность. Таблица 4 Распределение полиморфных аллелей, выявляемое у анализируемых сортов картофеля с помощью праймера 0025 Сорт Астана Альянс Мошняковский Когалы Алая Заря Шагалалы Жанайсан Кокчетавский ранний Мирас Никитка Тохтар Фирменный Нэрли Орбита Тамыр Тандем Улан Шортандинский Ягодный 19 К 4-7 Казахстанский Дуняша Бирлик Жуалы Аксор Ушконыр Тохтар 30 КФ Ауыл Кустанайские новости Акколь Аладин Латона Розара Невский Ресурс Лорх Елизавета Брянский ранний Жуковский ранний Журавинка Вектар Янка Лад Зорачка Уладар Лилея Бриз Скарб Манифест Пример 2. Способ идентификации сортов и форм картофеля с помощью микросателлитного праймера 0031. Из ростков глазков клубней и пробирочных растений выделяют ДНК способом, указанным выше. На каждой из выделенных ДНК осуществляют ПЦР с праймером 0031. Полученный ПЦР-продукт амплификации визуализируют путем электрофореза в полиакриламидном геле, а после окрашивают бромистым этидием и электрофореграммы фотографируют в УФ-свете, идентифицируют маркерные аллели различной длины,представляющие аллельные формулы сортов картофеля. На фиг.2, представлены полиморфные аллели для каждого сорта картофеля. Каждый из сортов характеризовался определенным сочетанием аллелей (таблица 5). Это распределение послужит эталоном при сравнении и идентификации растений неизвестных сортов картофеля. Путем сравнения распределения полиморфных ДНК разной длины среди исследуемых и эталонных сортов определяют сортовую принадлежность. Таблица 5 Распределение полиморфных аллелей, выявляемое у анализируемых сортов картофеля с помощью праймера 0031 Астана Альянс Мошняковский Когалы Алая Заря Шагалалы Жанайсан Кокчетавский ранний Мирас Никитка Тохтар Фирменный Нэрли Орбита Тамыр Тандем Улан Шортандинский Ягодный 19 К 4-7 Казахстанский Дуняша Бирлик Жуалы Аксор Ушконыр Тохтар 30 КФ Ауыл Кустанайские новости Акколь Аладин Латона Розара Невский Ресурс Лорх Елизавета Брянский ранний Жуковский ранний Журавинка Вектар Янка Лад Зорачка Уладар Лилея Бриз Скарб Манифест Таким образом,молекулярно-генетический паспорт по восьми парам праймерам составлен для каждого известного сорта и представлен в таблице 1. Аналогичный паспорт можно составить для любой выборки растений картофеля неизвестного происхождения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ идентификации сортов и форм картофеля, включающий выделение ДНК из ростков клубней и пробирочных растений картофеля, анализ геномной ДНК с помощью ПЦР, визуализацию аллелей ДНК с помощью электрофореза в агарозном и полиакриламидном геле,получение и идентификацию выявленных аллелей, составление молекулярно-генетических паспортов,отличающийся тем, что для каждого сорта и формы картофеля выявляют полиморфные аллели при использовании микросателлитных праймеров 0031, 1052, 1106, 0025, 0004,0012, 0032, 0033.