Способ germ-line генетической трансформации сои

(51) 12 15/82 (2011.01) 01 5/00 (2011.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ определение времени суток для успешного внедрения агробактерий с целевыми генами по пыльцевой трубке в зародышевый мешок и оплодотворения сои с участием целевого гена 5. молекулярно-биологическую детекцию интродукции трансгенов в геном сои в первом и втором поколениях. Предлагаемый способ исключает дорогостоящие,малоэффективные и длительные этапы культуры тканей и регенерации растений, генотип независим,сходен с естественным для растения половым оплодотворением,быстр,экономичен и сравнительно эффективен(эффективность трансформации 3 во втором поколении Т 2). Данный способ может превратить генетическую трансформацию сои в рутинный процесс, успешно используемый селекционерами и исследователями для повышения урожайности, устойчивости к болезням и абиотическим стрессам данной культуры. Способ относится к агробактериальной (с использованием герм элементов пыльцы,яйцеклетки, незрелых и зрелых зародышей,меристем, семян) генетической трансформации сои, . Разработка способа генетической трансформации сои с использованием естественных пыльцевых трубок обеспечивает трансфер(доставку) ДНК целевых генов с. путем подрезания рыльца пестика с последующим естественным опылением. ДНК достигает яйцеклетку через прорастающие пыльцевые трубки сразу же после опыления, и затем интегрируется в только что оплодотворенные, но еще не делящиеся клетки зиготы.(72) Кершанская Ольга Ивановна Дидоренко Светлана Владимировна Есенбаева Гульвира Лемисовна(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Институт биологии и биотехнологии растений Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(57) Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и генетической инженерии и может быть использовано для генетической трансформации сои, . с целью получения высокоурожайных и устойчивых к абиотическим стрессам форм с эффективностью трансформации 3. Задача изобретения - разработка нового способа- генетической трансформации сои путем агробактериального пипетирования цветков после оплодотворения с использованием естественных пыльцевых трубок. Разработка способа включает следующие основные этапы 1. разработку генетических конструкций целевых генов 2. подготовку эффективной суспензии агробактерий с агентами трансформации 3. отработку техники нанесения агробактериальной суспензии с геном интереса на цветок 4. оптимизацию стадии развития растения и цветка сои, подбор цветка и нодии, 25950 Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и генетической инженерии и может быть использовано для генетической трансформации сои, . с целью получения высокоурожайных и устойчивых к абиотическим стрессам форм с эффективностью трансформации до 3. Способ включает следующие основные этапы разработку генетических конструкций целевых генов подготовку эффективной суспензии агробактерий с агентами трансформации отработку техники нанесения агробактериальной суспензии с целевым геном на цветок оптимизацию стадии развития растения и цветка сои, подбор цветка и нодии, определение времени суток для успешного внедрения агробактерий с целевыми генами по пыльцевой трубке в зародышевый мешок и оплодотворения сои с участием целевого гена молекулярнобиологическую детекцию интродукции трансгенов в геном сои в первом и втором поколениях. Имеется большое количество работ по генетической трансформации сои,которые основаны на использовании таких методов трансформации как бомбардмент ( , , , . .( )-.., 1999. . 56., .37-46). Однако эти методы имеют ряд существенных недостатков они включают этапы культивирования клеток в культуреи регенерации растений,занимают 12-16 недель от изоляции экспланта до трансфера молодого растения в почву, весь процесс создания трансгенов составляет 320-380 дней, позволяют получать слабые химерные растения с низкой эффективностью трансформации, применяются только для одного или ограниченного числа сортов сои,интродуцируют 1-2 генетические конструкции целевых генов устойчивости к болезням или вредителям-.-...,1998. . 102., . 38-48) - то есть позволяют получать ограниченный биотехнологический продукт первого поколения. Недостатки данных методов генотип - зависимы, требует больших 2 затрат времени, оборудования / реагентов и средств на этапы культуры тканей и регенерацию растений,используют ограниченное количество генетических конструкций одного-двух целевых генов устойчивости к гербицидам, имеют относительно невысокую эффективность получения здорового продуктивного растения. В последнее время получили развитие методы генетической трансформации растений с использованием пыльцы, яйцеклетки, зародышей,семян, других половых элементов, - натуральных и естественных,приближенных к половому размножению, или так называемых, методовгенетической трансформации. Такие методы генетической трансформации сои занимают 90-120 дней - длину вегетационного периода сои от цветения до созревания, экономичны, позволяют получать здоровые растения,относительно эффективны (Н. , -, 2011,. , .., 1997. . 3, . 9-26.,.,..-, патент 20088867598, США). Одним из аналогов является патент, ,,.,, 20090077694, СШАот 19.03.2009 описывает-зависимую - генетическую трансформацию сои, . Способ основывается на доставке генов к индивидуальным клеткам свежевыросшей меристемы сои. Данные клетки могут непосредственно индуцировать формирование наземной части побега, из которой вырастают трансгенные растения. Преимущества способа - отсутствие необходимости в этапах культура тканей и регенерация растений. Недостатки - среди способов - генетической трансформации сои наиболее близким к естественному половому размножению является способ с использованием прорастающих пыльцевых трубок - такой как наш, т. к. данный способ позволяет избежать получение химерных неоднородных растений, и дает высокий выход семян,сравнимый с контрольными нетрансформированными формами. Прототипом данного способа является способ,предложенный . , , , ... -., 2002. . 29, . 111. Подробное описание прототипа - действия и условия их осуществления(признаки),характеризующие известный способ В соответствии с прототипом способ трансформации сои с использованием пыльцевых трубок осуществляют на сортах 82, ,63 ипутем подрезания рыльца пестика цветка после опыления и применения суспензий ДНК, содержащих - ген в плазмиде 1221 и- ген в плазмиде 0122. Было получено около 5000 семян. Трансгены с- геном не были подтверждены, морфофизиологические изменения наблюдали только в первом поколении предположительно трансгенов. 2 семян с геном были подтверждены гистохимическим анализом, в листьях присутствие данного гена не подтвердилось менее 3 семян второго поколения были подтверждены гистохимическим анализом на наличие - гена, но они не были подтверждены методом ПЦР. Существенными признаками прототипа,совпадающими с признаками предложенного способа являются объект - соя метод - трансформация (трансформация с использованием герм - элементов пыльцы, яйцеклетки, незрелых и зрелых зародышей,меристем,семян),не требующий дорогостоящих и длительных этапов культуры тканей,относительно простой,экономичный и эффективный естественный вектор доставки рекомбинантных ДНК в яйцеклетку на свежеоплодотворенные, но неделящиеся клетки зиготы являются прорастающие сразу же после опыления естественные пыльцевые трубки агробактериальное пипетирование. Данный способ является наиболее близким к естественному половому размножению, и биологичным, поскольку добавляет к генетическому материалу данной формы сои при оплодотворении целевую рекомбинантную ДНК. Недостатки прототипа 1. генотипическая зависимость, способ разработан для 4 конкретных сортов сои селекции США 2. время и способы агробактериального пипетирования определялись конкретными погодными условиями среднего запада США, штата Иллинойс и должны быть разработаны для условий Казахстана 3. исследования биологии развития сои не были проведены, 4. генетическими конструкциями являлись общеизвестные плазмиды 221,1910122 и- типичному гену для получения биотехнологического продукта первого поколения(один ген - устойчивость к одному биотическому фактору) 5. не оптимизирована подготовка агробактериальной суспензии с целевыми генами и агентами трансформации, не уточнена техника нанесения агробактериальной суспензии, не 3 уточнена оптимальная стадия, цветок, нодия, время суток для агробактериального пипетирования, не приведено молекулярно-биологическое подтверждение получения трансгенных растений методом ПЦР. Задача изобретения разработка эффективного способа генетической трансформации сои посредством пипетирования рыльца пестика цветков агробактериальной суспензией с целевыми генами с использованием - элементов - естественных пыльцевых трубок, прорастающих сразу после опыления и используемых в качестве вектора доставки рекомбинантной ДНК для интеграции в только что оплодотворенные, но еще не делящиеся клетки зиготы. Предлагаемый способ - оригинальный для сои. Способ - генетической трансформации сои осуществляют путем агробактериального пипетирования цветков сои после оплодотворения с использованием естественных пыльцевых трубок. Механизм данного способа основан на использовании естественного процесса прорастания пыльцевых трубок, которые формируются для проникновения спермия к зародышевому мешку,для транспорта хозяйственно-ценного генетического материала при трансформации. По пыльцевой трубке целевая ДНК достигает зиготы. Интересующий нас ген встраивается в геном культурного сорта растения. Трансформированные семена получают непосредственно без предварительной подготовки клеточной культуры и регенерации растения. Поставленная задача решается следующим образом Разрабатывают метод агробактериального пипетирования сои с использованием естественных пыльцевых трубок включением следующих этапов,устраняющих недостатки прототипа 1) разрабатывают генетические конструкции хозяйственно-ценных генови -123 2) подготавливают эффективную суспензию агробактерий с агентами трансформации 3) отрабатывают технику нанесения агробактериальной суспензии с геном интереса на цветок 4) оптимизируют стадию развития растения и цветка сои подбором цветка и нодии,определением времени суток для успешного внедрения агробактерий с генами интереса по пыльцевой трубке в зародышевый мешок и оплодотворения сои с участием целевого гена 5) проводят молекулярно-биологическую детекцию интродукции трансгенов в геном сои в первом и втором поколениях. Разрабатывают генетические конструкции хозяйственно-ценных генови 123. Конструкции основаны на двух базовых экспрессионных векторах ИОГен им. Н.И. Вавилова РАН в плазмидах 121, 19, и содержат 35 - сильный конститутивный промотор 35 РНК вируса мозаики цветной капусты, способный контролировать экспрессию целевого гена в двудольную культуру - сою- ген,кодирующий неомицинтрансферазу , которая обеспечивает устойчивость растений к селективному агенту канамицину ВМ 325950 последовательность репортерного гена, который кодирует термостабильную -1,3-1,4 - глюканазу(лихеназу). Генкодирует ключевой фермент С 4 метаболизма растений при фотосинтезе - пируват ортофосфат дикиназу, который способствуют высвобождению субстрата ФЕП (фосфоенол пирувата) и участвует в фосфорном обмене, высвобождая АТФ и . Гены,контролирующие С 4 ферменты, участвуют в основных энергетических и восстановительных процессах в растениях и действуют подобно транскрипционным факторам, сообщая растениям способность устойчивости к различным стрессам среды обитания и повышают их фотосинтетическую активность и урожай. Интродукция гена РЕРС(фосфоенолпируват карбоксилазы) из кукурузы в пшеницу привела к активизации фотосинтетической функции и оптимизации структуры фотосинтетического аппарата (Кершанская, -., , 4 ( 1), 2010, 27-34),обусловливающим оптимизацию продукционного процесса - повышение устойчивости к стрессам и увеличение урожайности. Интродукция другого важного С 4 гена - , в сою, обусловит повышение ее урожайности и устойчивости к абиотическим стрессам. Способность растительных клеток к адаптации в условиях стресса связывают с их способностью изменения текучести мембран посредством изменения количества ненасыщенных жирных кислот в мембранных липидах. Знания биохимии и молекулярной биологии десатураз жирных кислот позволяет создание генов для интродукции в сельскохозяйственные растения, способствующих их устойчивости к абиотическим факторам. Ген 123 сообщает растениям устойчивость к низким температурам и засолению. 2. Подготовку эффективной суспензии агробактерий с агентами трансформации осуществляют следующим образом. Одну колонию агробактерий переносят в 3 мл средыи инкубируют 1-1,5 суток при 28 С на шейкере с частотой 250 оборотов/мин. Очистку агробактерий проводят осаждением на центрифуге при 4500 в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 3 мл средыбез антибиотика,измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при 600 нм. В ходе исследований установлено,что оптимальная плотность агробактерий для трансформации сои пипетированием составляет 6-8 клеток/мл. К 1,5 мл суспензии агробактерий с целевым геном добавляют 1,5 мкл 1 плурониковой кислоты в качестве агента трансформации для повышения агрессивности зоны Т-плазмид. Известно, что двудольные культуры, к которым относится соя, вырабатывают ацетосирингон в клетках. Поэтому проводят часть опытов в отсутствие агентов трансформации. 3. Отработку техники нанесения агробактериальной суспензии с целевыми генами на рыльце пестика цветка сои проводят на созданных и 4 районированных в Казахстане сортах сои Эврика,Белгородская 6, Радость, Гибридная 670, Вита,Надежда, Риза, Нина, Тажан, Казахстанская 2309. Лепестки отделяют, и производят надрез цветка в области пестика таким образом, чтобы удалить 1/3 рыльца с помощью маленьких ножниц (фиг. 1). Около 5-8 мкл агробактериальной суспензии экзогенной ДНК с агентами трансформации помещают в открытый цветок микрошприцем. Через 30 минут проводят проверку цветков, и если ДНК испаряется, проводят повторную обработку. 4. Оптимизация стадии развития растения и цветка сои. Для оптимизации стадии развития растения и цветка сои проводят изучение биологии развития сои (фиг. 2). Показано, что развитие цветка и завязи включает восемь фаз, подготовка к опылению проходит в течение первой и второй фаз, а созревание тычинок, высыпание пыльцы на клейкое рыльце и оплодотворение - в третьей и четвертой фазах, когда лепестки венчика еще плотно сомкнуты. Пыльники лопаются и пыльца,попадая на рыльце, начинает формировать пыльцевую трубку. Подбор цветка и нодии, определение времени суток для успешного внедрения агробактерий с генами интереса по пыльцевой трубке в зародышевый мешок и оплодотворения сои с участием целевого гена проводят на основе анализа особенностей роста пыльцевых трубок во времени. Показано выделение рыльцем веществ,стимулирующих прорастание пыльцы в 900 прикрепление пыльцы к рыльцу,начало прорастания пыльцы в 915 и прорастание пыльцевой трубки в 930 (фиг. 3). С помощью данных наблюдений определяют оптимальное время пипетирования и усовершенствуют его технику при агробактериальной трансформации сои с использованием прорастающих пыльцевых трубок. В 800 утра удаляют все цветки, которые открылись накануне, оставляют только бутоны,которые раскроются в данный день. На каждом узле 6-7 нодий оставляют 1-2 бутона. Пипетирование цветков сои проводят с 1100 до 1500 в тот же день,когда цветы открылись и образовавшиеся пыльцевые трубки способны пропускать нужный генетический материал, в тот же период времени наблюдают максимальную активность пыльцы. С геномпри удалении части рыльца сформировано 106 бобов (36,3 от числа пипетированных цветков). С целевым геном 123 с удалением одной трети рыльца сформировано 197 бобов (35,8 от числа пипетированных цветков), тогда как без удаления процент завязываемости составляет 31,1 и 38,0 соответственно. Описанным методом генетической трансформации сои получено около 3000 семян из цветков,обработанных рекомбинантной ДНК с генамии 123, сообщающих устойчивость растений к абиотическим стрессам и повышающих их урожай. 5. Молекулярно-биологическую детекцию интеграции целевых генов в геном трансгенных линий сои в первом и втором поколениях (1 и Т 2) проводят методом ПЦР. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводят с целью идентификации генов(фиг. 3) и 123 (фиг. 4-6). Рассчитывают праймеры к целевым генам к гену, прямой - 5- АСС ТССТТ-3, обратный - 5- ТТС-3, с экспрессирующей областью 645 нп, к гену -123, прямой - 5-АТС ССТАА-3, обратный - 5-ТСС СТСТТС-3, с экспрессирующей областью 690 нп, включающий область с 425 нп до 1115 нп. Определяют программу для проведения ПЦР на Амплификаторе-, ,путем расчета(температуры плавления ДНК прямого и обратного праймеров) для гена 68 для прямого и 68 С для обратного праймеров,для гена 123 - 64 и 68 С для прямого и обратного праймеров соответственно. Оптимизируют условия проведения реакции амплификации температуру отжига,продолжительность синтеза ДНК, концентрацию растительной ДНК. В результате выбирают следующие условия амплификации, пригодные также для проведения мультиплексного ПЦР,выравнивая все праймеры по температуре отжига 94 С - 2 мин., 94 С - 30 сек., 62 С - 30 сек., 72 С 1 мин., 35 циклов, 72 С - 5 мин., сохранение продукта при -4 С. Проводят анализ продуктов ПЦР методом горизонтального электрофореза в 1 агарозном геле с применением маркера молекулярных масс 1 или 100. Проводят ПЦР-анализ растительной ДНК предположительно трансгенных растений первого и второго поколений 10 сортов сои отечественной селекции, или районированных в Казахстане сортов, предварительно скринированных на устойчивость к антибиотику канамицин в соответствии с маркерным геном , включенным в конструкции данных целевых генов. Всего скринировано на устойчивость к канамицину 1101 предположительно трансгенное семя сои Т 0 с интродуцированным геноми 1536 семян Т 0 с интродуцированным геном 123. Эффективность трансформации по результатам скрининга предположительно трансгенной сои на антибиотик канамицин в концентрации 160-180 мг/л составила 7,9 для трасгенов с геноми 11,0- для трансгенов с геном 123 (таблица 1). Таблица 1 Эффективность трансформации сои 1 и Т 2, полученной способом- генетической трансформации, в результате скрининга на антибиотики и ПЦР-анализа Трансгены сои интродуцированными генами Скрининг на антибиотик канамицин, 160 мг/л исходколиче- эффекное ство тивколивыживность чество ших транссемян растеформа 0, шт. ний, 0, ции,шт. В первом поколении методом ПЦР подтверждены 19 трансгенных растений сои с геномиз 87, и 29 из 169 трансгенных растений сои с геном 123, прошедших скрининг на антибиотик канамицин. Эффективность трансформации по результатам ПЦР анализа составила 21,8 и 17,2 соответственно от числа выживших после скрининга на антибиотики растений и 1,73 и 1,89 соответственно от общего числа семян,полученных методом агробактериального пипетирования сои с использованием естественных пыльцевых трубок. ПЦР-анализом подтверждена вставка интродуцированных генов в геном трансгенных растений сои второго поколения Т 2 с эффективностью трансформации 3 в среднем. Наличием вставки интродуцированных генов в геном сои во втором поколении подтверждают стабильную генетическую трансформацию сои. 5 количество растений сои со вставкой интродуцированных генов в геном, шт. эффективность трансформации,от числа выживших растений после скринига 21,8 17,2 16,8 эффективность трансформации,от исходного количества семян Таким образом, доказана генетическая трансформация сои способом агробактериального пипетирования целевых генов с использованием естественных пыльцевых трубок в качестве вектора переноса рекомбинантной ДНК. Использование данного способа открывает возможности для простой интродукции целевых генов, которые могут повысить устойчивость сои к болезням и абиотическим стрессам, улучшить качество зерна, повысить уровень микроэлементов и витаминов в растении,модифицировать фотосинтез и увеличить продуктивность. Предлагаемый способ исключает дорогостоящие,малоэффективные и длительные этапы культуры тканей и регенерации растений, генотип независим,сходен с естественным для растения половым оплодотворением,быстр,экономичен и сравнительно эффективен(эффективность трансформации 3 во втором поколении Т 2). Новый способ - генетической трансформации сои посредством агробактериального пипетирования с использованием естественных пыльцевых трубок превращает процесс трансформации сои в рутинный процесс,доступный многим селекционерам и исследователям. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ - генетической трансформации сои, включающий - (с использованием герм- элементов пыльцы) генетическую трансформацию сои путем агробактериального пипетирования цветков с использованием естественных пыльцевых трубок для доставки рекомбинантных ДНК в зиготу минуя этапы культуры тканей и регенерации растений, отличающийся тем, что трансфер целевых генов в яйцеклетку созданных и районированных в Казахстане сортов сои с. осуществляют путем подрезания рыльца пестика с последующим естественным опылением через прорастающие пыльцевые трубки с интеграцией ДНК в только что оплодотворенные,но еще не делящиеся клетки зиготы создают эффективные генетические конструкций целевых генов подготавливают эффективную суспензию агробактерий с целевыми генами и агентами трансформации отрабатывают технику нанесения агробактериальной суспензии с целевыми генами на цветок сои оптимизируют стадию развития растения и цветка подбирают цветок и нодии определяют время суток для успешного внедрения агробактерий с целевыми генами в зародышевый мешок и оплодотворения сои с участием целевых генов проводят молекулярно-биологическое подтверждение итродукции трансгенов в геном сои в первом и втором поколениях (Т 1 и Т 2).