Способ определения антигенов HLA класса I и II в лейкоцитах пуповинной крови

(51) 01 33/53 (2009.01) 01 33/577 (2009.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ пуповинной крови. Комбинированный способ определения антигеновклассаив лейкоцитах пуповинной крови для последующей оценки биологической совместимости донора и реципиента при трансплантации стволовых/прогениторных клеток пуповинной крови заключается в том, что в лейкоцитах пуповинной крови донора серологическим методом выявляют и типируют антигены тканевой совместимости класса, а антигеныклассаопределяют методом ПЦРанализа. Предложенный способ позволяет распознавать аллели в локусах главного комплекса гистосовместимости лейкоцитовклассаив пуповинной крови в количестве, достаточном для последующей оценки определения степени биологической совместимости донора и реципиента. Предложенный способ надежен, относительно прост и дешев, позволяет снизить потери пуповинной крови в одном образце до 6 мл и ускорить получение результатов анализа до 4-6 часов.(72) Рысулы Мустафа Сатыбалдиева Жаннат Абеновна Давлятшин Тимур Ильфритович Туремуратов Ален Болатович(73) Акционерное общество Национальный инновационный фонд Товарищество с ограниченной ответственностью СТЭМКОРД(56) Румянцев А.Г., Масчан А.А. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток у детей Руководство для врачей. М. Медицинское информационное агенство, 2003, с. 912 Патент РФ 2237249, кл. 01 33/577, 2004 Патент РФ 2002115475, кл. 01 33/577, 2004(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНОВКЛАССАИВ ЛЕЙКОЦИТАХ ПУПОВИННОЙ КРОВИ(57) Изобретение относится к области медицины, а именно к трансплантологии и может быть использовано для оценки биологической совместимости донора и реципиента при трансплантации стволовых/прогениторных клеток 18294 Изобретение относится к области медицины, а именно, к трансплантологии и может быть использовано для оценки биологической совместимости донора и реципиента при трансплантации стволовых/прогениторных клеток пуповинной крови. Ключевую роль в инициации и развитии реакции отторжения играют генетические детерминированные антигены тканевой совместимости, находящиеся на мембране клеток различных тканей. Определяющее значение для индивидуальности организма при трансплантации играет система лейкоцитарных антигенов, который получил название(от англ.-), являющийся главным комплексом гистосовместимости человека. В зависимости от структурных и функциональных особенностей,антигены (и кодирующие их гены)подразделяются на несколько классовкласс ,куда входят антигены -, -,-класс ,куда входят антигены -,-,- и некоторые другие, икласс , включающий многочисленные гены с разнообразными функциями. В трансплантологии варианты доноров и реципиентов тестируют только накласси-несовместимость является главной причиной клинических и иммунологических проблем после трансплантации и основным лимитирующим фактором выбора донора для трансплантации (Шевченко Ю.Л., Жибурт Е.Б. Безопасное переливание крови руководство для врачей. СПб Издательство Питер, 2000, с. 320). Антигены системыи антитела к ним имеют большое значение при многих состояниях,связанных с трансфузией. К ним относятся аллоиммунизация и рефрактерность тромбоцитов,лихорадочная негемолитическая трансфузионная реакция, связанное с переливанием острое поражение легких и пост-трансфузионная болезнь трансплантат против хозяина. -антигены в высокой степени иммуногенны. При беременности или трансфузии, иммунологически полноценные реципиенты с гораздо большей вероятностью будут вырабатывать антитела к , чем к любым другим антигенам. Известен серологический способ определения биологической совместимости тканей, путем выявления и типирования антигенов системы ,основу которого составляет специфическое взаимодействие антитела и антигена. Этот способ получил широкое распространение благодаря своей простоте, достаточно хорошей воспроизводимости,относительной дешевизне и возможности его стандартизации. Набор гистотипирующих сывороток, определяющий антигены А, В и С локусов системы , должен выявлять не менее 30 антигенов класса(Правила по службе крови Республики Казахстан, 2000, Приложение 7. Правила иммунологического типирования, с. 1-5). Для типирования антигенов класса(-,-) обычно достаточно 5 мл крови. Однако для типирования антигенов класса(-, -,-) требуется от 20 до 40 мл крови. Объем 2 получаемой от новорожденного пуповинной крови составляет в среднем 70-80 мл, поэтому использование 20-40 мл крови на типирование антигенов класса(-,-,-) практически лишит образец пуповинной крови половины стволовых/прогениторных клеток, что сделает его клиническое использование не эффективным. Недостатками метода также являются высокая фоновая гибель клеток и их низкая исходная жизнеспособность в ходе их выделения, инкубации и экспозиции с реагентами. Влияют на результаты и избыток антигена, обусловленный избыточным количеством клеток, экспрессирующих антигены(лимфоциты, моноциты, тромбоциты). Известен способ молекулярно-генетического определения класса( технология),основанный на амплификации специфических участков ДНК пациента при помощи специфических праймеров (Румянцев А.Г., Масчан А.А. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток у детей Руководство для врачей. М. Медицинское информационное агентство, 2003, с. 912). Этот способ получил название полимеразной цепной реакции (ПЦР). Каждая пара праймеров помещается в отдельную пробирку ПЦР планшета. Специфические продукты окрашиваются бромистым этидием, результаты интерпретируются при помощи компьютерной программы. Преимущества метода используется всего 0,1-0,5 мл пуповинной крови. Одновременно можно типировать кровь от 1 до 4 человек. Типирование,основанное на анализе ДНК, имеет несколько преимуществ по сравнению с серологическим методом высокая чувствительность и специфичность, небольшие объемы проб, быстрое проведение отдельных этапов исследования (до нескольких часов), отсутствие необходимости использовать живые клетки и наличия антигенов на поверхности клетки. Если серологическими методами можно выявить лишь около 15-35 аллелей-антигенов,то ДНК-методы позволяют идентифицировать уже более 100 аллелей. Недостатком способа является его существенная дороговизна по сравнению с обычным серологическим методом определения антигенов класса . Задачей данного изобретения является разработка комбинированного способа определения антигеновклассаив лейкоцитах пуповинной крови для последующей оценки биологической совместимости донора и реципиента по системе главных антигенов гистосовместимостиклассаипри трансплантации стволовых/прогениторных клеток пуповинной крови, использующихся для трансфузии при лечении пациентов с заболеваниями различного генеза,обеспечивающего упрощение и значительную дешевизну способа. Для определения антигенов гистосовместимостиклассаипри предполагаемой трансплантации стволовых/прогениторных клеток пуповинной крови 18294 используется комбинация серологического и типирующими сыворотками по 1 мкл на лунку и молекулярно-генетического методов. инкубируют в течение 1 часа при температуре 22 Сущность предложенного способа и его 23 С. Затем в каждую лунку добавляют 5 мкл отличительная особенность заключается в том, что свежезамороженного кроличьего комплемента и антигены класса(-.-.-) типируют с инкубируют 1 час. После инкубации с комплементом в каждую помощью комплемент-зависимого микролимфоцитотоксического теста Терасаки, а лунку закапывают 3 мкл. 5 эозина и через 3 антигены класса(-1) типируют с минуты 5 мл 40 формальдегида. Через 30 мин производят подсчет числа мертвых клеток под применением ПЦР-анализа. Способ осуществляют следующим образом. инвертированным микроскопом. Результаты Для выполнения комплемент-зависимого оценивают по шкале оценки интенсивности реакции микролимфоцитотоксического теста Терасаки в цитотоксическом тесте. Полимеразную цепную реакцию проводят с используются лейкоциты пуповинной крови,типирующие сыворотки и комплемент (кроличья использованием стандартных наборов реагентов сыворотка). 5 мл пуповинной крови в наслаивают на фирмы ДНК-технология (Россия), определяют на градиент плотности в центрифужной пробирке в амплификаторе фирмы(США). Выделяют соотношении 13 и центрифугируют в течение 30 ДНК из лейкоцитов пуповинной крови, добавляют минут при 1500 об/мин. Надосадок осторожно образцы ДНК в реакционную ПЦР-смесь для отсасывают и переносят в другую чистую амплификации и проведения полимеразной цепной центрифужную пробирку, дважды промывают реакции с последующим электрофорезом и фосфатным буфером, затем центрифугируют при детекцией ДНК. Специфичность образовавшихся продуктов 1000 об/мин. Осадок(промытые клетки) ресуспендируют, доводя концентрацию до 2-4- амплификации определяют по их отношению к 10 х 106 в 1 мл. Полученные клетки лейкоцитов расположению на агарозном геле полос маркера раскапывают микрошприцем в планшеты Терасаки с длин амплифицированных фрагментов. Маркер длин амплифицированных фрагментов Номер полосы (отсчет сверху вниз) Длина п.н. 110 х 67 2 Определение специфичности гена 1 проводилось при следующих длинах продукта (количество аминокислот в полинуклеотиде или п.н.) Смесь 1 14 1 07,09 Специфичность Все специфичности 104 107 109 101 110 115 102 116 102 103,05,06,08 108 0116111(05) 112(05) 114(06) 117(03) 118(03) 113(06), 11 1 13(06), 03 Предложенный способ позволяет распознавать 18294 гистосовместимости лейкоцитовклассаив пуповинной крови в количестве, достаточном для последующей оценки определения степени биологической совместимости донора и реципиента. Способ надежен, прост, позволяет снизить потери пуповинной крови в одном образце до 6 мл и получить результаты анализа в течение 4-6 часов. Способ обладает значительной дешевизной по сравнению с применением для типирования антигенов класса(-,-,-) -технологии. Пример 1. В стерильных условиях в родильном отделении родильного дома у новорожденного ( 203) из пуповинной вены были взяты 2 образца крови первый объемом 5 мл помещен в пробирку типа вакутейнер, содержащую антикоагулянт гепарин для серологического типирования антигенов в микролимфоцитотоксическом тесте Терасаки,второй образец объемом 0,5 мл помещен в стерильную пластиковую пробирку типа вакутейнер ЭДТА 3,6 мг для ПЦР анализа специфичностей-1 антигеновкласса . Первый образец наслаивают на градиент плотности в центрифужной пробирке в соотношении 13 и центрифугируют в течение 30 минут при 1500 об/мин. Надосадок осторожно отсасывают и переносят в другую чистую центрифужную пробирку, дважды промывают фосфатным буфером, затем центрифугируют при 1000 об/мин. Осадок(промытые клетки) ресуспендируют, доводя концентрацию до 2-410106 в 1 мл. Полученную взвесь лейкоцитов вносят микрошприцем в объеме 1 мкл в каждую лунку плашки Терасаки с типирующими сыворотками известной специфичности антигеновклассапо 1 мкл на лунку и инкубируют в течение 30 минут при температуре 22-25 С. Затем в каждую лунку добавляют 5 мкл свежезамороженного кроличьего комплемента и инкубируют в течение 60 минут при температуре 22-25 С. После инкубации с комплементом в каждую лунку закапывают микрошприцем 3 мкл 5 эозина и через 3 минуты 5 мл 40 формальдегида. Через 30 минут, когда клетки в лунке осядут на дно,производят подсчет числа мертвых клеток под инвертированным микроскопом. Живые клетки не окрашиваются и имеют небольшие размеры. Погибшие клетки включают краситель, имеют более крупные размеры, распластаны на дне лунки,опалесцируют. Полученные результаты оценивались по условной шкале Шкала оценки интенсивности реакции в цитотоксическом тесте Терасаки Условные единицы Доля лизированных клеток в Сильно выраженная положительная реакция Реакция не поддается оценке Результат серологического типирования антигеновклассаобразца пуповинной крови 203 следующие А 2,3 В 8,511,7 6. Второй образец центрифугируют при 1000 об/мин, надосадок сливают и в осадок добавляют лизирующий раствор,центрифугируют и перемешивают на вортексе. Сливают надосадок,полученную суспензию раскапывают по пробиркам с добавленными праймерами на антигены локусов 1 (01,10- 107,09- 104115- 116- 108,11-112,1403113(1)113(2,ДНКполимеразой и минеральным маслом. Каждая опытная пробирка перед постановкой в термоциклер содержит 5 мкл разбавителя 1 4 мкл одной из смесей, имеющих маркировку смесь 1, смесь 2 пробирки с названием специфичностей- 0.1 мкл ДНЗС-полимеразы- 1 каплю минерального масла (приблизительно 10 мкл)- 1 мкл раствора выделенной ДНК. Переносят пробирки в помещение для работы с амплифицированным материалом, помещают в термоциклер и задают программу. Для проведения амплификации используют программу,приведенную для амплификатора типа МС 2,запрограммированного на объем 10 мкл в режиме активного,быстрого По окончании амплификации проводят электрофорез. После электрофореза оставшиеся продукты используют для второй амплификации. Помещают пробирки в амплификатор, задают программу. Для проведения амплификации используют программу,приведенную для амплификатора типа МС 2, запрограммированного на объем 10 мкл в режиме активного, точного Детекция ДНК производится следующим образом в каждую из лунок 3 агарозного геля под буфер отдельным наконечником вносят по 5 мкл окрашенного амплификата. В одну из лунок геля вносят 5 мкл из пробирки с маркировкой Маркер длин. Электрофорез проводят при напряжении 200250. Далее по шкале длин проводится сопоставление амплифицированных продуктов и маркеров п.н. для определения аллельных специфичностей. Результат 203 4,3,7,11 Итоговый результат обследования образца пуповинной крови 203 выглядит следующим образом Пример 2. В стерильных условиях в родильном отделении родильного дома у новорожденного ( 239) из пуповинной вены были взяты 2 образца крови первый объемом 5 мл помещен в пробирку типа вакутейнер, содержащую антикоагулянт гепарин для серологического типирования антигенов в микролимфоцитотоксическом тесте Терасаки,второй объемом 0,5 мл помещен в стерильную пластиковую пробирку типа вакутейнер с ЭДТА 3,6 мг для ПЦР анализа специфичностей -1 антигеновкласса . Первый образец наслаивают на градиент плотности в центрифужной пробирке в соотношении 13 и центрифугируют в течение 30 минут при 1500 об/мин. Надосадок осторожно отсасывают и переносят в другую чистую центрифужную пробирку, дважды промывают фосфатным буфером, затем центрифугируют при 1000 об/мин. Осадок(промытые клетки) ресуспендируют, доводя концентрацию до 2-410 х 106 в 1 мл. Полученную взвесь лейкоцитов вносят микрошприцем в объеме 1 мкл в каждую лунку плашки Терасаки с типирующими сыворотками известной специфичности антигеновклассапо 1 мкл на лунку и инкубируют в течение 30 минут при температуре 22-25 С. Затем в каждую лунку добавляют 5 мкл свежезамороженного кроличьего комплемента и инкубируют в течение 60 минут при температуре 22-25 С. После инкубации с комплементом в каждую лунку закапывают микрошприцем 3 мкл. 5 эозина и через 3 минуты 5 мл 40 формальдегида. Через 30 мин, когда клетки в лунке осядут на дно, производят подсчет числа мертвых клеток под инвертированным микроскопом. Живые клетки не окрашиваются и имеют небольшие размеры. Погибшие клетки включают краситель, имеют более крупные размеры, распластаны на дне лунки,опалесцируют. Полученные результаты оценивались по условной шкале (табл. 2). Результат серологического типирования антигеновклассаобразца пуповинной крови 239 следующие А 1,(2324) В 35,44 46 4,6. Второй образец центрифугируют при 1000 об/мин, надосадок сливают и в осадок добавляют лизирующий раствор,центрифугируют и перемешивают на вортексе. Сливают надосадок,полученную суспензию раскапывают по пробиркам с добавленными праймерами на антигены локусов 1 (101,10- 107,09- 10415116108,11-112,145 18294 103113(1)113(2,ДНКполимеразой и минеральным маслом. Каждая опытная пробирка перед постановкой в термоциклер содержит 5 мкл разбавителя 1 4 мкл одной из смесей, имеющих маркировку смесь 1, смесь 2 пробирки с названием специфичностей- 0,1 мкл ДНК-полимеразы- 1 каплю минерального масла (приблизительно 10 мкл)- 1 мкл раствора выделенной ДНК. Переносят пробирки в помещение для работы с амплифицированным материалом, помещают в термоциклер и задают программу. Для проведения амплификации используют программу,приведенную для амплификатора типа МС 2,запрограммированного на объем 10 мкл в режиме активного,быстрого По окончании амплификации проводят электрофорез. После электрофореза оставшиеся продукты используют для второй амплификации. Помещают пробирки в амплификатор, задают программу. Для проведения амплификации используют программу,приведенную для амплификатора типа МС 2, запрограммированного на объем 10 мкл в режиме активного, точного Детекция ДНК производится следующим образом в каждую из лунок 3 агарозного геля под буфер отдельным наконечником вносят по 5 мкл окрашенного амплификата. В одну из лунок геля вносят 5 мкл из пробирки с маркировкой Маркер длин. Электрофорез проводят при напряжении 200250. Далее по шкале длин проводится сопоставление амплифицированных продуктов и маркеров п.н. для определения аллельных специфичностей. Результаты 239 1 01.1,118(3) 9, 112(5)10. Итоговый результат обследования образца пуповинной крови 239 выглядит следующим образом Предложенным комбинированным способом исследовано распределение -антигенов классаи в лейкоцитов пуповинной крови новорожденных 32 новорожденных. Полученные результаты исследования 32 образцов пуповинной крови представлены в табл. 2. При этом выявлено, что серологический метод типирования антигеновклассас использованием микролимфоцитотоксического теста Терасаки достаточно убедительно подтверждает наличие локусов А, В и С на клетках пуповинной крови, которые позволяют определить индивидуальный фенотип по числу распознанных аллельспецифичных антигенов в локусах главного комплекса гистосовместимостикласса . Установлен полиморфизм антигеновкласса для лимфоцитов 32 образцов пуповинной крови. Применение метода ПЦР идентифицировало полиморфизм аллелей генов локусаклассадля лимфоцитов 32 образцов пуповинной крови. ПЦР-анализ показывает многообразие аллельных вариантов гена . Количество распознанных аллелей в локусах главного комплекса гистосовместимости лимфоцитов пуповинной крови приведено в табл. 3. 18294 Таблица 2 Результаты определения -антигенов классаив лимфоцитах пуповинной крови новорожденных (32) 18294 Таблица 3 Число распознанных аллелей в локусах главного комплекса гистосовместимостилейкоцитов пуповинной крови Полученные результаты могут быть использованы для последующей оценки определения степени биологической совместимости донора и реципиента. Предложенный способ надежен, относительно прост и обладает значительной дешевизной. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ определения антигеновклассаив лейкоцитах пуповинной крови, включающий определение антигенов Н классас помощью полимеразной цепной реакции, отличающийся тем,что антигены Н классаопределяют и типируют с использованием гистотипирующих сывороток в микролимфоцитотоксическом тесте Терасаки.