Способ получения лекарственной мази Розеофунгин-АС, обладающей противогрибковой и антивирусной активностью

(51) 61 9/06 (2006.01) 61 31/00 (2006.01) 61 35/66 (2006.01) 61 31/10 (2006.01) 61 31/12 (2006.01) 12 1/465 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ антибиотика из биомассы продуцента применяют 95,9-96,0 этиловый спирт, антибиотик очищают путем 3-х кратного переосаждения в дистиллированной воде, для приготовления мази порошок очищенного антибиотика растворяют в диметилсульфоксиде в соотношении антибиотик розеофунгиндиметилсульфоксид 12, в качестве мазевой основы используют смесь полиэтиленоксида-400 и полиэтиленоксида-1500 в соотношении 7222, в конечном продукте соотношение масс компонентов (на 100 г) составляет- полиэтиленоксид 1500 - 21,99 - 22,00 Преимущество изобретения заключается в разработке простого и эффективного способа получения лекарственной мази Розеофунгин-АС с противогрибковой и противовирусной активностью,позволяющего производить высокоактивный лекарственный препарат в промышленных масштабах.(76) Саданов Аманкелди Курбанович Березин Владимир Элеазарович Балгимбаева Ася Султановна Треножникова Людмила Петровна(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ МАЗИ РОЗЕОФУНГИНАС, ОБЛАДАЮЩЕЙ ПРОТИВОГРИБКОВОЙ И АНТИВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ(57) Использование медицина и ветеринария, в частности, микробиология и вирусология, а именно производство и применение новых противогрибковых и противовирусных препаратов. Цель разработка простого и эффективного способа получения лекарственной мази Розеофунгин-АС, обладающей противогрибковой и антивирусной активностью. Сущность изобретения в качестве продуцента антибиотика розеофунгин используют высоко продуктивный вариант 5 штамма.1-68, для выделения 30752 Изобретение относится к фармацевтике, в частности к технологии производства антибиотиков,используемых в медицине и ветеринарии. Как известно, микозы, вызываемые патогенными грибками, являются большой проблемой для медицины и ветеринарии. Микозы человека представляют собой обширную группу заболеваний,вызываемых более чем 500 разновидностями патогенных грибков. Не меньшее число микозов встречается и у животных. Многие патогенные грибки вызывают заболевания, как у человека, так и у животных и могут передаваться при контакте с последними. Микозами в различной степени поражено от 10 до 20 взрослого населения,процент зараженности значительно возрастает в старших возрастных группах. В возрасте 70 и более лет этим недугом страдает уже около 50 населения. Наблюдается быстрый рост микозов по всем возрастным группам населения, причем в последние годы отмечается тенденция к увеличению заболеваемости микозами не только у взрослых, но и у детей. Грибковые поражения отличаются большой вредоносностью и разнообразием локализации. Описаны грибковые поражения центральной нервной системы, больших полушарий мозга, мозжечка, легких, желудочно-кишечного тракта, костной системы, кровяного русла, кожи и ее придатков. Вирусные заболевания, являются не менее актуальной проблемой, чем грибковые инфекции. Ряд вирусов вызывают поражение кожи и слизистых оболочек(вирус простого герпеса,вирус генитального герпеса, вирусы папилломы и кандилломы человека и др.), причем многие из них способны вызывать раковое перерождение клеток и приводить к онкозаболеваниям. Как грибковые, так и вирусные инфекции часто приводят к значительному снижению иммунитета. Также, уменьшение иммунных функций организма способствует развитию тяжелых форм микозов и вирусных инфекций. Например,при иммунодефицитных состояниях,вызванных вирусом иммунодефицита человека, основными причинами смерти становятся тяжелые рецидивирующие грибковые, бактериальные и вирусные поражения органов и систем организма. Имеющиеся в настоящее время на рынке противовирусные и противогрибковые препараты в основном являются малоэффективными, к ним развилась лекарственная устойчивость, они не обладают широким спектром активности, зачастую токсичны. Поэтому разработка и производство новых противогрибковых и противовирусных препаратов является насущной проблемой, весьма актуальной для фармацевтики, медицины и ветеринарии. Особую ценность имеет разработка препаратов,обладающих одновременно противогрибковой и антивирусной активностью. Одним из немногих препаратов, сочетающих противогрибковое действие и антивирусную активность, является полиеновый антибиотик розеофунгин, продуцируемый микроорганизмом. Показано, что антибиотик 2 розеофунгин весьма эффективен против поверхностных и глубоких микозов различной локализации, а также обладает антивирусной активностью в отношении орто-, парамиксовирусов и герпесвирусов. Известна технология получения полиенового противогрибкового антибиотика Нистатин. Данный антибиотик продуцируется микроорганизмом. Для получения антибиотика продуцент высевают на кукурузно-глюкозную питательную среду,содержащую не менее 4 углерода и 40-60 мг фосфора. Из образовавшейся мицеллиальной массы производят экстракцию антибиотика органическим растворителем, в качестве которого используют метиловый спирт. Для удаления органического растворителя производят отгонку в ротационном испарителе. После отгонки препарат промывают и высушивают под вакуумом (Способ производства противогрибкового антибиотика - нистатина. А.с. СССР 136856 от 04.08.1978). Недостатками данной технологии является использование дорогостоящей кукурузно-глюкозной среды для культивирования продуцента,применение высокотоксичного органического растворителя для экстракции антибиотика. Кроме того, получаемый антибиотик неэффективен против многих грибковых инфекций и не обладает антивирусной активностью. Известна технология получения полиенового противогрибкового антибиотика леворин,продуцируемого культурой. Данный антибиотик активен в отношении дрожжеподобных грибов родаи некоторых простейших ( ) ( ,.1997. 24. 235-47). Для получения антибиотика продуцент высевают на ферментационную среду без твердых остатков,содержащую в качестве источников углеводов глюкозу и крахмал, в качестве источников азота сернокислый аммоний и кукурузный экстракт. Антибиотик получают путем экстракции мицелия продуцента органическим растворителем. В качестве органических растворителей используется метиловый спирт или диметилформамид. После экстракции органический растворитель удаляют методам ротационного испарения (,Патент США 3476856 А от 05.05.1964). Недостатками данной технологии является использование дорогостоящей кукурузно-глюкознокрахмальной среды для культивирования продуцента,применение высокотоксичного органического растворителя для экстракции антибиотика. Получаемый антибиотик является высокотоксичным(гепатотоксичность,нефротоксичность, способность провоцировать желудочные и маточные кровотечения). К данному антибиотику у многих возбудителей грибковых 30752 инфекций родавыработалась лекарственная устойчивость, вследствие чего его применение часто является малоэффективным. Данный антибиотик не обладает антивирусной активностью. Известна технология получения полиенового противогрибкового антибиотика Амфотерицин Б. Данный антибиотик продуцируется микроорганизмом. Для получения антибиотика продуцент культивируют на органической питательной среде, после чего образовавшийся мицелий экстрагируют растворителем демитилформамидом,дробно осаждают в системе диметилформамид-вода при кислом значениисреды и промывают 50 водным раствором пропилового спирта. Полученную пасту промывают ацетоном, сушат в вакууме, после чего повторно промывают пропиловым спиртом,отделяют центрифугированием,повторно промывают ацетоном и сушат в вакууме (Способ получения Амфотерицина Б. А.с. СССР 271725 от 30.11.1979). Недостатки данной технологии заключаются в ее сложности, необходимости использования больших количеств токсичных органических растворителей для очистки антибиотика,конечным продуктом данной технологии является антибиотик, обладающий достаточно высокой токсичностью и низкой активностью в отношении многих возбудителей грибковых инфекций. Кроме того, полученный антибиотик не обладает антивирусной активностью. Технология получения антибиотика Амфотерицин В выбрана заявителем в качестве прототипа. Таким образом,известные технологии производства противогрибковых антибиотиков являются недостаточно эффективными, сложными,требуют применения токсических реагентов и приводят к получению антибиотиков, которые характеризуются избирательностью действия только на определенные виды возбудителей микозов и имеют достаточно высокую токсичность. Кроме того,данные антибиотики не обладают антивирусным действием. Задачей изобретения является разработка промышленного способа получения лекарственной мази Розеофунгин-АС,обладающей противогрибковой и антивирусной активностью. Способ промышленного получения лекарственной мази Розеофунгин-АС, обладающей противогрибковой и антивирусной активностью,состоит из нескольких этапов. Для получения антибиотика используют более продуктивный вариант 5 штаммаа.1-68, полученный в результате селекции исходного штамма.1-68. Этот более активный продуцент обеспечивает выход биомассы до 50 г/л, что позволяет использовать его в промышленном производстве. Состав питательной среды имеет большое значение для повышения активности биосинтеза антибиотика розеофунгин, что важно для создания эффективной технологии его производства. Подобран состав питательной среды (среда РФГ),обеспечивающей высокий выход целевого продукта при крупномасштабном культивировании. Среда РФГ включает следующие компоненты (г/л) овсяная мука - 30,0 глюкозы моногидрат - 20,0 лактозы моногидрат - 20,0 углекислый кальций 5,0. Указанные компоненты растворяют в дистиллированной воде,среды 7,00,1. Выращивание мицелия продуцента антибиотика проводится в три фазы на первой - посевной материал выращивают в колбах, на второй производят выращивание посевного материала в инокуляторе,на третьей осуществляют масштабирование процесса в ферментере. После завершения культивирования полученный мицелий отделяют от культуральной среды путем центрифугирования и отжима. Далее осуществляют экстракцию антибиотика из биомассы мицелия органическим растворителем. В качестве экстрагента используют этиловый спирт, вместо использовавшихся ранее в производстве органических растворителей ацетона и бутанола,что упрощает и удешевляет производство. Полученный этанольный экстракт упаривают в роторном испарителе до водного остатка. Антибиотик розеофунгин очищают из препаратасырца путем переосаждения в дистиллированной воде, при этом исключается использовавшаяся ранее стадия очистки антибиотика путем переосаждения в серном эфире. Это также упрощает и удешевляет производство. Окончательно очищенный антибиотик высушивают до порошкообразного состояния. Для получения лекарственной мази порошок очищенного антибиотика розеофунгин смешивают с диметилсульфоксидом в соотношении 12 и затем полученную смесь вносят в мазевую основу. В качестве мазевой основы используется смесь полиэлитеноксида-400 и полиэтиленоксида-1500 в соотношении 7222. Полученную мазь расфасовывают в тубы. Сущность изобретения поясняется на следующих примерах Пример 1. Выращивание посевного материала и наработка мицелия для выделения антибиотика. На чашки Петри со стерильной питательной средой РФГ, содержащей агар в количестве 20 г/л,наносят по 0,2 мл суспензии исходного спорового материала продуцента вариант 5 штамма.1-68 в разведениях. Засеянные чашки помещают в термостат при температуре 281 С, и посевной материал выращивают в течение 7 суток. Отбирают колонии желтого цвета, равномерно-складчатые, с высоким профилем. Из одной колонии с указанными признаками делают посев в 10 пробирок. Посевы выдерживают в термостате при 281 С не более 5 суток. Затем их хранят в холодильнике при температуре 2-8 С и используют в течение двух месяцев. Выбраковываются пробирки с растущим мицелием, на которых есть участки бесцветного роста и участки с бело 3 30752 розовым бархатистым или мучнистым воздушным мицелием. На первой фазе для выращивания вегетативного посевного мицелия в колбы со стерильной жидкой средой РФГ вносят в асептических условиях посевной материал из пробирок. Из одной пробирки засевают 2 колбы со средой. Вегетативный посевной мицелий выращивают в колбах в течение 48 часов на орбитальном шейкере с частотой вращения 200220 оборотов в минуту при температуре 281 С. За время инкубации в колбах вырастает густая мицелиальная масса светло-желтого цвета. При микроскопировании наблюдается фрагментация гиф мицелия. Гифы однородные с базофильной протоплазмой. На второй фазе производят выращивание посевного материала в инокуляторе. Для этого полученный посевной вегетативный мицелий помещают в инокулятор в количестве 5 к объему питательной среды. Посевной мицелий в инокуляторе выращивают в течение 48 часов с частотой вращения мешалки 200-300 оборотов в минуту при температуре 281 С. Режим аэрации переменный в первые сутки - 1 литр воздуха на 1 литр среды в минуту, во вторые сутки - 0,5 литра воздуха на 1 литр среды в минуту. Для поддержанияна уровне 6,8-7,0 в реактор вводят 20 раствор гидроокиси натрия. При микроскопировании наблюдается фрагментация гиф мицелия. Гифы однородные с базофильной протоплазмой. На третьей фазе производят выращивание мицелия в ферментере. К ферментеру со стерильной питательной средой РФГ, охлажденной до температуры 281 С, стерильно подсоединяют инокулятор с посевной культурой. Засев производят передачей посевной культуры из инокулятора в количестве 5-8 от объема питательной среды в ферментер. Биосинтез антибиотика в ферментере проводят при температуре 281 С в течение 72 часов, частота вращения мешалки переменная,400-300 оборотов в минуту. Режим аэрации переменный в первые сутки - 1 литр воздуха на 1 литр среды в минуту, во вторые сутки - 0,5 литра воздуха на 1 литр среды в минуту. Режимсреды в ферментере на уровне 6,8-7,0 поддерживают путем внесения 40 раствора гидроокиси натрия. Пример 2. Отделение биомассы мицелия и экстракция антибиотика из мицелия продуцента. Мицелий извлекают из ферментера и отделяют от жидкой фазы путем центрифугирования, после чего отжимают между листами фильтровальной бумаги. Выход мицелия должен составлять не менее 40-50 г на 1 литр культуральной среды. Экстракцию антибиотика осуществляют в два этапа, в качестве экстрагента используют 95,9-96,0 этиловый спирт. Первый этап экстракции проводится при соотношении экстрагента и биомассы мицелия равном 31. Экстракцию ведут с использованием механических мешалок в течение 2 часов при комнатной температуре в вытяжном шкафу. Затем экстракцию продолжают в холодильнике при температуре 2-8 С в течение 3 часов. Спиртовой экстракт отделяют от биомассы 4 фильтрованием первоначально через ткань, затем повторно экстракт фильтруют через фильтровальную бумагу. Второй этап экстракции проводится при соотношении экстрагентбиомасса равном 21. Экстракцию проводят, как описано выше. Первый и второй этанольные экстракты объединяют. Объединенный этанольный экстракт упаривают в вакууме на ротационном испарителе при температуре 35-40 С до водного остатка. Получают препарат-сырец - густую массу от желтого до темно-желтого цвета. Пример 3. Осаждение, очистка и сушка антибиотика. Для осаждения антибиотика в качестве осадителя используют дистиллированную воду. К препарату-сырцу добавляют 5-кратное количество дистиллированной воды и выдерживают в течение 60 минут при комнатной температуре. Получают суспензию антибиотика в водной фазе. Водную суспензию антибиотика центрифугируют и осадок трижды промывают 5-кратным количеством дистиллированной воды также используя центрифугирование. Полученный осадок антибиотика высушивают с использованием вакуумной или лиофильной сушки. Высушенную массу измельчают на электрической мельнице до гомогенного порошкообразного состояния, и порошок упаковывают в пластиковые пакеты. До получения результатов анализов порошок хранят в сухом, защищенном от света месте при температуре 2-8 С. Пример 4. Идентификация антибиотика и оценка его биологической активности. Порошок антибиотика анализируют по основным показателям с использованием методов химического и микробиологического анализа,абсорбционной спектрофотометрии и биологического тестирования, в сравнении со стандартным образцом розеофунгина. Идентификацию антибиотика проводят методами абсорбционной спектрофотометрии в ультрафиолетовой и видимой областях и тонкослойной хроматографии. 25,0 мг порошка розеофунгина помещают в мерную колбу вместимостью 25,0 мл, растворяют в 15,0 мл диметилсульфоксида, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают. 1 мл полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора спиртом этиловым 96 Р до метки (испытуемый раствор). Ультрафиолетовый спектр поглощения испытуемого раствора в области от 300 до 400 нм должен иметь максимум при длине волны 3643 нм. 10.0 мг порошка розеофунгина помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, растворяют в 5,0 мл спирта этилового 96. Раствор нагревают на водяной бане при температуре 40 С до полного растворения вещества. Полученный раствор остужают и доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают. На линию старта хроматографической пластинки наносят 10 30752 мкл (10 мкг) испытуемого раствора, пластинку сушат на воздухе и помещают в камеру с системой растворителей спирт н-бутиловый - вода - эфир диэтиловый (221). Когда фронт растворителя пройдет 15 см от линии старта, пластинку вынимают из камеры, сушат на воздухе в течение 10 мин и просматривают в УФ-свете при длине волны 254 нм. На хроматограмме испытуемого раствора должно обнаруживаться основное пятно желтого цвета со значениемв области 0,55-0,65. Определение родственных примесей проводят методом тонкослойной хроматографии по вышеприведенному методу. Проводят определение микробиологической чистоты антибиотика. В 1.0 г антибиотика допускается наличие не более 100 аэробных бактерий и грибов (суммарно) и не более 10 энтеробактерий и некоторых других грамотрицательных бактерий. В 1.0 г антибиотика не допускается наличиеи. Для определения биологической активности используют питательную среду . Посевная доза тест-микроорганизма составляет 1,0 мл рабочей взвеси на 100,0 мл среды . Засев проводят при температуре среды 48-50 С. В каждую чашку Петри разливают по 15,0 мл засеянной среды , чтобы в них образовался однородный слой толщиной от 2 мм до 5 мм. Розлив засеянной средыв чашки Петри проводится на горизонтально ровной поверхности. Используя растворитель и фосфатный буферный раствор с 6,0, готовят растворы испытуемого антибиотика,предполагаемые концентрации которых не имеют существенных отличий от соответствующих концентраций стандартного образца. 10,0 мг розеофунгина помещают в мерную колбу вместимостью 10,0 мл, растворяют в 5,0 мл диметилсульфоксида. Доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают. Дальнейшее разведение основного раствора готовят в фосфатном буферном растворе с 6,0 до нужной концентрации розеофунгина (50, 25, 12,5 мкг/мл). Срок хранения растворов розеофунгина в фосфатном буферном растворе с 6,0 при комнатной температуре не более 1 часа. Растворы вносят в лунки диаметром 7 мм,подготовленные в засеянной питательной среде . Во все лунки вносят равные объемы растворов. Следует использовать не менее трех доз стандартного образца розеофунгина и трех соответствующих доз испытуемого образца,имеющих предположительно ту же активность. Число повторностей для одной дозы при каждом определении должно быть не менее 6. Растворы испытуемого образца и стандартного образца чередуют таким образом, чтобы исключить взаимодействие более концентрированных растворов. Чашки инкубируют при температуре 37 С в течение 18-24 часов. Для уменьшения влияния разницы во времени между внесением растворов и для уточнения линии регрессии используют предварительную диффузию при температуре около 4 С продолжительностью 4 ч. Измеряют диаметры круглых зон угнетения роста с точностью не менее 0,1 мм и рассчитывают активность, используя статистический метод. Исследуемый образец субстанции должен содержать не менее 500 ЕД/мг, что соответствует минимальной подавляющей концентрации антибиотика розеофунгина 2 мкг/мл. Пример 5. Приготовление лекарственной мази Розеофунгин-АС. Процесс приготовления лекарственной мази Розеофунгин-АС состоит из нескольких стадий подготовка мазевой основы,подготовка лекарственного вещества для внесения в мазь,введение лекарственного вещества в мазь. В качестве мазевой основы для приготовления лекарственной мази используют смесь полиэтиленоксида-400(ПЭО-400) и полиэтиленоксида-1500 (ПЭО-1500) в соотношении 72 г ПЭО-400 и 22 г ПЭО-1500 на 100 г лекарственного средства. Оба компонента расплавляют в плавильном котле. Плавление начинают с более тугоплавкого соединения (ПЭО 1500), который первым загружают в котел и расплавляют в плавильной ванне при 60-65 С. После расплавления ПЭО-1500 до прозрачной жидкой массы вносят расчетное количество ПЭО 400. Основу мази в герметичном реакторе перемешивают в течение 30 минут, скорость перемешивания 505 об/мин. Перед внесением антибиотика розеофунгин в мазевую основу порошок антибиотика смешивают с растворителем диметилсульфоксидом при соотношении антибиотикрастворитель 12. Смешивание активного вещества с растворителем проводят с использованием механической мешалки до образования густой однородной пастообразной массы желтого или темно-желтого цвета. К расплавленной мазевой основе последовательно при перемешивании добавляют небольшими порциями концентрат розеофунгина в диметилсульфоксиде до конечной концентрации розеофунгина в мазе 2. В конечном продукте лекарственной мази Розеофунгин-АС соотношение масс компонентов- полиэтиленоксид 1500 - 21,99 - 22,00 Полученную смесь перемешивают в течение 1 часа с помощью мешалки (скорость вращения 70 10 об/мин), поддерживая температуру смеси 30 2 С. Смесь через 1 час структурируется и приобретает консистенцию упруго-пластичной массы желтого цвета. Дальнейшее перемешивание и охлаждение ведут при работающей мешалке,уменьшая скорость перемешивания до 505 об/мин в течение 0,5-1 ч. Общее время перемешивания 1,5-2 часа. После завершения гомогенизации мазь фасуют в алюминиевые тубы, укупоренные крышкой с перфорационным пробойником. Фасовку проводят при температуре мази 302 С на тубонаполнительной машине. 5 30752 Практическая ценность лекарственная мазь Розеофунгин-АС обладает выраженной противогрибковой активностью и антивирусной активностью, что позволяет использовать ее для борьбы с широким спектром грибковых и вирусных заболеваний. Преимуществом используемого в технологическом процессе высокоактивного продуцента вариант 5 штамма.1-68 является повышенная биосинтетическая активность и способность продуцировать антибиотик с высокой противогрибковой и антивирусной активностью. Преимуществом использования для наработки биомассы продуцента культуральной среды РФГ является высокий уровень продукции мицелия,позволяющий получить выход не менее 40-50 г мицелия с 1 л среды в условиях культивирования в ферментере. Преимуществом использования для экстракции антибиотика из биомассы мицелия органического растворителя этанола является низкая токсичность растворителя и его безопасность применения в производственном процессе. Преимуществом применения для очистки антибиотика в качестве осадителя дистиллированной воды является отсутствие токсичности и низкая стоимость. Преимуществом использования для приготовления мазевой основы лекарственного средства смеси полиэтиленоксида-400 и полиэтитленоксида-1500 является низкая токсичность компонентов и простота получения мазевой основы. Преимуществом применения диметилсульфоксида для растворения антибиотика перед введением в мазевую основу является низкая токсичность этого компонента и хорошая смешиваемость с мазевой основой. В целом преимущество данного изобретения заключается в разработке простого и эффективного способа получения лекарственной мази Розеофунгин-АС с противогрибковой и противовирусной активностью,позволяющего производить высокоактивный лекарственный препарат в промышленных масштабах. Предлагаемый способ позволит наладить промышленный выпуск лекарственной мази Розеофунгин-АС в Республике Казахстан и расширить арсенал лечебных противогрибковых и антивирусных препаратов. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения лекарственной мази Розеофунгин-АС, обладающей противогрибковой и антивирусной активностью, отличающийся тем,что в качестве продуцента антибиотика розеофунгин используют высокопродуктивный вариант 5 штамма.168, для выделения антибиотика из биомассы продуцента применяют 95,9-96,0 этиловый спирт, антибиотик очищают путем 3-х кратного переосаждения в дистиллированной воде, для приготовления мази порошок очищенного антибиотика растворяют в диметилсульфоксиде в соотношении антибиотик розеофунгиндиметилсульфоксид 12, в качестве мазевой основы используют смесь полиэтиленоксида-400 и полиэтиленоксида-1500 в соотношении 7222, в конечном продукте соотношение масс компонентов (на 100 г) составляетантибиотик розеофунгин 1,99-2,00 диметилсульфоксид 3,99-4,00 полиэтиленоксид 400 71,99-72,00 полиэтиленоксид 1500 21,99-22,00.