Способ обнаружения ДНК Brucella abortus

(51) 61 39/40 (2006.01) МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН(57) Изобретение относится к микробиологии и молекулярной диагностике, и может быть использовано в лабораторной диагностике бруцеллезной инфекции. Предлагаемый способ диагностики предусматривает выделение ДНК,синтез праймеров и постановку ПЦР с использованием синтезированных специфических праймеров, проведение электрофореза в агарозном геле и анализ полученных электрофореграмм. Способ позволяет обнаруживать ДНКс довольно высокой степенью точности в короткие сроки, что позволяет диагностировать данную инфекцию за 3 часа, без предварительного накопления тестируемого материала и может быть использован для экспресс-идентификации.(72) Матвеева Валентина Михайловна Кошеметов Жумагали Каукарбаевич Богданова Марина Ивановна Строчков Виталий Михайлович Сансызбай Абылай Рысбайулы(73) Республиканское государственное предприятие на праве хозяйственного ведения Научноисследовательский институт проблем биологической безопасности Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан(54) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ДНК Изобретение относится к микробиологии и молекулярной диагностике, и может быть использовано в лабораторной диагностике бруцеллезной инфекции. Способ предусматривает проведение полимеразной цепной реакции с праймерами к гену 19 01580 19,анализ реакционной смеси с помощью электрофореза в агарозном геле и выявление ДНК штаммовп результатам анализа. Способ позволяет осуществлять экспресс-идентификацию. Изобретение может быть использовано для обнаружения,основанного на детекции генетического материала возбудителя и предназначено для массовых анализов. Бруцеллез- опасная инфекционная болезнь животных и людей, характеризующаяся поражением многих систем жизнеобеспечения,нарушением функций сосудистой,пищеварительной, мочеполовой систем и системы воспроизводства. Успех в ликвидации очага бруцеллеза во многом определяется качеством применяемых диагностических тестов, главными критериями которых являются специфичность,высокая чувствительность и эффективность. Для диагностики бруцеллеза в ветеринарной практике используют такие методы,как бактериологический,серологический,реже аллергический. Однако, особенности течения бруцеллезной инфекции, несмотря на многообразие применяемых средств и методов диагностики, не позволяют при однократном исследовании выявить всех больных бруцеллезом животных(Триленко П.А., 1976 Сочнев В.В., 1984 Косилов И.А. и др., 1999., 1997 Григорьева Г.И. и др., 1998 Ощепков В.Г. и др,2004 и другие). Причем,бактериологическая диагностика бруцеллеза весьма трудоемкая и продолжительная по времени выполнения. Эффективность бактериологического метода зависит от качества питательных сред, концентрации возбудителя в исследуемом материале, степени загрязненности последнего посторонней микрофлорой и времени,прошедшего с момента заражения животного. Срок бактериологического исследования составляет 15-30 суток, а при постановке биологической пробы он увеличивается вдвое (Журнакова М.А.,1959 Штритер В.А. и др, 1937). Серологическая диагностика осложняется антигенным родством между бруцеллами и другими микроорганизмами,в частности,что обусловливает получение ложноположительных реакций, кроме того, она не позволяет дифференцировать антитела,синтезированные на полевые культуры и вакцинные штаммы бруцелл(М.М., -,1980 Желудков М.М.,1982 Гайдар Б., Желудков М.М.,Чернышева М.И., 1994.,,., 2000). Дифференциальная диагностика бруцеллеза возможна при исследовании сыворотки крови 2 животных в реакции иммунодиффузии в геле агара с 0-ПС антигеном ИЭВСиДВ. Однако по чувствительности этот метод уступает комплексу классических серологических реакций(Антонов Б.И. и др, 1994. Традиционно применяемые диагностические методы не позволяют оперативно дифференцировать бруцеллы на уровне видов и штаммов, что затрудняет проведение эпизоотологического и эпидемиологического анализа и рациональное использование средств специфической профилактики бруцеллеза. Уровень техники Описан метод диагностикис применением ПЦР, разработанный,,,,,.711//,12,2 (2007). В котором показана разработка и применение полимеразной цепной реакции для обнаруженияв различных клинических образцах(печень,почки,лимфатические узлы и матка). Метод сравнивали со стандартными бактериологическими и серологическими тестами. Были подобраны праймеры на ген 711 и фрагмент из хромосомной ДНК. Пара праймеров дает ПЦРпродукт размером 157 п.о. Амплифицированная ДНК обнаруживается с помощью электрофореза в агарозном геле. Результаты показали, что с помощью ПЦР и бактериологического методов может диагностировать В.в клинических образцах с подозрением на бруцеллез. При исследовании образцов от крупного рогатого скота образцы двумя методами видно, что метод ПЦР показал гораздо более высокую чувствительность. ДНК В.была обнаружена во всех 10 образцах и только 5 образцов были положительными в стандартных бактериологических методах. В серологическими тестах наблюдались некоторые перекрестные реакции с рядом родственных бактерий, которые могут влиять на интерпретацию результатов. Таким образом, предлагаемый авторами набор праймеров показал удовлетворительную чувствительность и специфичность Известны исследования по обнаружениюв крови, молоке и лимфатической ткани серологический положительных коров с помощью полимеразной цепной реакцией (ПЦР),М,Т.,//. 2006 81(2) 170-6.200620. В данном исследовании была оценена целесообразность использования традиционных и ПЦР в реальном времени анализов в качестве потенциальных диагностических средств для выявленияу естественно инфицированных коров.не была обнаружена в образцах крови, собранной от естественно инфицированных коров, обычными или ПЦР в реальном времени, но была обнаружена в положительных культурах молока (44) и лимфатической ткани (66 заглоточный, 75 - надвыменной лимфоузлы). Не было разницы между ПЦР и бактериологическим методом обнаружения,но диагностическое применение ПЦР на бруцеллез может быть хорошей альтернативой по сравнению с традиционными методами, предоставляя результаты в течение короткого периода времени. Известен способ обнаружения, идентификации и дифференциации видов и вакцинных штаммов родаПатент 02006097347,, дата публикации 21.09.2006. Способ пригоден для определения рода,идентификации и дифференциации видов и вакцинных штаммов,посредством множественной ПЦР на основе отдельных геномных ДНК фрагментов. Так например, для В.были выбраны локусы 0072 и ВиА 20168,которые имели последовательности, характерные для В.и отсутствовали у других видов. Указанный способ позволяет обнаруживать, дифференцировать и выявлять штаммы В. , Б. , В. , Б. суис,Б. , Б. , изоляты бруцелл морских млекопитающих, и вакцинных штаммов В.19 (В 19), Б.51 и В.1. Признаками,отличающими предлагаемое изобретение от перечисленных аналогов, являются нуклеотидные последовательности праймеров,приведенные в перечне последовательностей,специфические компоненты реакции и методические подходы при постановке ПЦР. Технической задачей изобретения является создание способа экспресс-идентификации В.на основе полимеразной цепной реакции. Способ диагностики бруцеллеза высокочувствительным и специфичным методом ПЦР позволяет точно и быстро (до 3 часов) выявлять ДНК В. . Предлагаемый способ диагностики предусматривает выделение ДНК В. , синтез праймеров,постановку ПЦР,проведение электрофореза в агарозном геле и анализ полученных электрофореграмм. Поставленная задача решается путем подбора пар олигонуклеотидных праймеров, специфичных для вида. Для идентификации В.методом ПЦР в качестве мишени нами была выбрана нуклеотидная последовательность гена 19 01580, кодирующего белок, отвечающий за трансмембранный перенос. Данный ген имеет размер 5796 пн и несет в себе область отсутствующую у других видов . Сущность изобретения заключается в том, что подобраны нуклеотидные последовательности, специфичные дляи разработан способ идентификации данного возбудителя с помощью ПЦР на участок гена 19 01580, кодирующего белок, отвечающий за трансмембранный перенос. ДНКвыявляется, если после разделения части реакционной смеси в агарозном геле, в анализируемом образце выявляются фрагменты ДНК размером 238 нуклеотидных пар для праймеров, специфичных гену 19 01580 вида. Праймеры подбирали и анализировали с использованием программы -на сайте////-. Характеристики праймеров устанавливали с использованием программы . Отсутствие гомологии с ДНК других видов родаи других возбудителей являлось основным критерием отбора олигонуклеотидов. Таким образом, для гена 19 01580 была подобрана пара праймеров, которая отличалась высокой генетической консервативностью и присутствовали только у видаи, в то же время, отсутствовали в ДНК других видов родаи других возбудителей. Рассчитанные олигонуклеотиды были синтезированы на автоматическом синтезаторе 8909 ((США по стандартной методике. Синтез праймеров проводили поэтапным достраиванием нуклеотида,согласно его нуклеотидной последовательности. Предложенный способ включает в себя одностадийную реакцию ПЦР с праймерами,специфичными к участку гена 19 01580. Праймеры -2 (прямой),состоят из 20 нуклеотидов. Реакционную смесь анализируют с помощью электрофореза в 1 агарозном геле. Присутствие в анализируемом образце фрагментов ДНКразмером 238 нуклеотидных пар свидетельствует о наличии в исходном материале ДНК. Предлагаемый способ диагностики бруцеллеза методом ПЦР является высокочувствительным и специфичным и позволяет достоверно определять наличие ДНКв биологических пробах без предварительного накопления тестируемого материала. Техническим результатом изобретения является повышение экономичности, сокращение времени проведения диагностической идентификациис помощью ПЦР. Изобретение может быть использовано для обнаружения бруцелл, основанного на детекции генетического материала возбудителя и предназначено для массовых анализов. Способ выполняется следующим образом 1. Выбор последовательности праймеров. Данный этап работы представлял собой аналитический процесс, который включал сбор имеющихся нуклеотидных последовательностей,как полных геномов, так и отдельных геновиз различных международных баз данных. Получить подробную информацию можно из международных компьютерных банков данныхчерез сеть Интернет. С целью подбора праймеров для постановки специфической ПЦР,был проведен сравнительный анализ нуклеотидных 3. Подбор праймеров проводили с помощью программы на сайте////-. Необходимо было подобрать фрагмент молекулы ДНКтаким образом, чтобы два его концевых участка, находящиеся на расстоянии 200-600 нуклеотидов друг от друга, отличались бы по своей структуре генетической консервативностью и присутствовали только уи, в то же время, отсутствовали в ДНК других видов родаи других возбудителей. При подборе праймеров учитывали все возможные критерии, влияющие на дальнейшую амплификацию, а именно- составоснований не более 60 и не менее 40- высокая специфичность на 3-конце праймера- разница не более 3-5 С между температурами плавления праймеров- размер ПЦР продукта в пределах 200-600 п.н. Важно отметить, что не совсем удачный выбор праймера может привести к появлению неспецифического продукта амплификации из-за образования праймерного димера. Этот побочный продукт амплификации представляет собой двунитевой фрагмент, возникающий за счет отжига праймеров с их последующей достройкой полимеразой. Праймеры должны быть специфичны. Если их специфичность недостаточна, то вероятней всего в пробирке с реакционной смесью будут происходить нежелательные процессы, а именно синтез неспецифической ДНК. При электрофорезе неспецифическая ДНК выявляется в виде тяжелых или легких дополнительных полос, иногда шмеров,выглядящих сплошным мазком в агарозном геле. Часть праймеров и дНТФ расходуется на синтез неспецифической ДНК,что приводит к значительной потере чувствительности. Полученные праймеры были проверены на специфичность с использованием программы. В результате для данного гена были отобрана одна пара праймеров, имеющая 100 гомологию с(таблица 1). Пара праймеров -2 и -2 дает ПЦРпродукт размером 238 п.н. Таблица 1 Основные характеристики специфических праймеров на ген 19 01580 для постановки ПЦР на 2. Синтез олигонуклеотидов. Компьютерномоделированные последовательности праймеров в дальнейшем синтезировали на синтезаторе олигонуклеотидов. Синтез ДНК проводили согласно протоколам, прилагаемым к прибору. Полученные олигонуклеотиды элюировали с колонок концентрированным раствором аммиака и выпаривали в вакуумном испарителе, . Преципитат праймеров растворяли в ТЕ буфере и переосаждали этанолом. Полученные таким образом синтезированные праймеры используются для постановки ПЦР. 3 .Выделение ДНК из образцов. Выделение ДНК проводили с использованием наборав соответствии с наставлением по применению данного набора. 1) В пробирку на 1,5 см 3 добавляли 20 мкл протеиназы К и 200 мкл исследуемого образца,300 мкл лизирующего буфера , 15 сек перемешивали на вортексе. 2) Смесь инактивировали при 56 С (10 мин),добавляли 200 мкл 96 этанола и ресуспендировали на вортексе 15 сек. Содержимое наслаивали на колонку с фильтром,затем осаждали центрифугированием в течение 1 мин при 8000 об/мин. 4 3) Добавляют 500 мкл промывочного буфера 1, а затем осаждают центрифугированием в течение 1 мин при 8000 об/мин. 4) Добавляют 500 мкл промывочного буфера 2, а затем осаждают центрифугированием в течение 3 мин при 14000 об/мин. 5) Осадок ресуспендируют в 200 мкл АЕ-буфера. Инкубируют при комнатной температуре (15-25 С) 1 минуту. Центрифугируют при 8000 об/мин. в течение 1 мин. 4. Проведение ПЦР с праймерами,специфичными к участкам гена 19 01580. В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь наобразцов, в число которых входят положительный и отрицательный контроли. Реактивы вносят в следующей последовательности. Фермент добавляют в последнюю очередь. Используется реакционная смесь следующего состава (50 мкл)(50 мкл) х 10 ПЦР буфер (200 мМ Трис НС,8,4, 500 мМКС) 5 мкл, 0,5 мкл 25 м 2, 0,5 мкл(10 мМ), по 0,5 мкл праймеров (20 пмоль каждый), 0,2 ед полимеразы в конечной концентрации, 2 мкл ДНК. Смесь перемешивают и раскапывают по 48 мкл в пробирки. Затем в них вносят отдельным наконечником по 2 мкл ДНК соответствующих анализируемых или контрольных образцов (К и К-). Пробы вносят в амплификатор со следующим температурным режимом пре-денатурация 5 мин, 94 С денатурация 20 с, 94 С отжиг 1 мин, 60 С 30 циклов синтез 20 с, 72 С пост-репликация 5 мин, 72 С 5.Детекция продуктов амплификации. Детекция продуктов амплификации проводится методом электрофореза в 1,0 растворе агарозы в ТАЕ- буфере. Электрофорез проводят в течение 30 минут при напряжении 60 (3-5 вольт/см) на аппарате- 100 . Визуализацию полосы ДНК осуществляют с помощью бромистого этидия. Результаты электрофореза просматривают в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе Трансиллюминатор. Результаты реакции выявляются в виде светящихся полос. Положительными считают пробы, полосы в которых располагаются в геле на уровне полосы положительного контроля. Исследуемые пробы считают отрицательными, если в них не выявлено никаких полос или полосы не соответствуют по размеру фрагменту в контрольной пробе (т.е. располагаются на другом расстоянии от старта). В отрицательном контроле не должно выявляться никаких полос. Присутствие в отрицательном контроле окрашенных фрагментов на уровне полос положительного контроля свидетельствует о перекрестной контаминации в процессе анализа. Результаты аннулируются. Анализ необходимо провести заново. Рисунки 1 и 2 демонстрируют конечный результат предлагаемого способа диагностики. При определении специфичности ПЦР в исследованиях использовали ДНК В. , других видов возбудителяи гетерогенные пробы. Результаты данных опытов представлены на фиг.1. М - маркер ДНК 1, 1- эталонный штамм В. 544 2-вакцинный штамм В. 19 3 - эталонный штамм В.16-М 4 - эталонный штамм . 1330 5 - штамм В. 63/290 6 - эталонный штамм В.1066 7 - штамм . -21 . 8-вода. Для определения чувствительности реакции использовали штамм .544 в виде клеточных лизатов с концентрацией микробных клеток от 2 до 200000000 м-к/см 3. Результаты данных опытов представлены на фиг.2. М - маркер ДНК, 1-200000000 м.к/см 3,2-20000000 м.к/см 3,3-2000000 м.к/см 3,3 3 4-200000 м.к/см , 5-20000 м.к/см , 6-2000 м.к/см 3,7-200 м.к/см 3, 8-20 м.к/см 3, 9-2 м.к/см 3,10-положительный контроль. Таким образом,предлагаемый способ диагностики бруцеллеза методом ПЦР специфичен и высокочувствителен. Специфический ПЦРпродукт нарабатывается только в присутствии ДНК В. , предел обнаружения составил 2 микробные клетки бруцелл в пробе. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ обнаружения ДНК,предусматривающий проведение реакции амплификации на ген 19 01580, анализ реакционной смеси с помощью электрофореза в агарозном геле и выявление ДНК по результатам анализа,отличающийся тем, что в качестве праймеров для проведения реакции амплификации в ПЦР,используют олигонуклеотиды из 20 звеньев, -2,комплементарные не менее чем на 100 гену 19 01580, выявление в анализируемых образцах продуктов ПЦР (фрагментов ДНК) размером 238 нуклеотидных пар при использовании праймеров, специфичных к гену 19 01580,свидетельствует о наличии в исходном материале ДНК.