Способ криоконсервации спермы козлов-производителей

(51) 61 19/00 (2006.01) 12 5/06 (2006.01) КОМИТЕТ ПО ПРАВАМ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МИНИСТЕРСТВА ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ Предлагаемый способ осуществляется применением стальной канистры прикрепленной к измерительной линейке,вместимостью 100 соломинок, высотой -13 см, диаметром-4 см,толщиной стенки-0,08 мм, с отверстиями в стенке 0,4 мм и на донышке-0,1 мм. Способ включает в себя получение, разбавление и расфасовку спермы в соломинки, эквилибрацию 15-20 мин, при комнатной температуре, маркировку, помещение соломин в канистру. Способ отличается тем, что при разбавлении спермы со средой используют криопротекторы ВИЖ и , расфасовку спермы проводят с помощью вакуумной камеры в силиконовые соломинки вместимостью 0,5 мл(,),открытые концы соломинок герметизируют с помощью клея и раскладывают в штатив-рамку, помещают в холодильник на 2 часа, охлаждают до 4 С, при этом используют канистру из нержавеющего стального листа вместимостью 100 соломинок. Заморозка начинается на уровне 7 см, от поверхности жидкого азота,измерив его мерной линейкой непосредственно в горловине сосуда Дьюара. Далее канистра с соломинками постепенно опускается со скоростью 1 см. в минуту и после касания поверхности азота, полностью погружается в него. После замораживания, соломинки переносятся в другие сосуды Дьюара для дальнейшего длительного хранения.(72) Тойшибеков Макен Молдабаевич Тойшибеков Ержан Макенович Молжигитов Бекежан Батырханович Аскаров Серикбек Мусанович Валиева Гулим Азатовна Токтабеков Думан Адилгазиевич Молдабаев Ерлан Мелисович Осбанов Даурен Куандыкович(73) Товарищество с ограниченной ответственностью Институт экспериментальной биологии им. Ф.М. Мухамедгалиева(56) Малмаков Н.И., Асылбеков Г.К. Способ замораживания спермы баранов в соломинках//Научно-производственный центр животноводства и ветеринарии МСХ РК(54) СПОСОБ КРИОКОНСЕРВАЦИИ СПЕРМЫ КОЗЛОВ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ(57) Изобретение относится к технологии консервации биологических объектов,замораживанию спермы высокопродуктивных козлов-производителей. Цель изобретения - упрощение технологии замораживания одновременная криоконсервация спермы в соломинках, экономия времени, жидкого азота, снижение затрат, защита от воздействия внешних и патогенных факторов, повышение сохранности биологической активности спермиев до и после замораживания. Изобретение относится к технологии криоконсервации биологических объектов,замораживанию спермы высокопродуктивных козлов-производителей. Способ криоконсервации спермы козловпроизводителей включает в себя расфасовку разбавленного эякулята в соломинки и замораживание одновременно максимального количества доз спермы от козлов-производителей. Способ отличается простотой выполнения, высокой эффективностью, экономией жидкого азота и непродолжительностью во всей совокупности манипуляций, а также надежной защитой от загрязнения патогенной микрофлорой. Для криоконсервации, хранения и последующего искусственного осеменения коз применяются известные способы заморозки. При этом используется свежеполученная сперма от клинических здоровых самцов,отвечающая требованиям общепринятых стандартов. В настоящее время разработаны различные по составу криопротекторы пригодные для осуществления криоконсервации спермы быков,буйволов,баранов, козлов, жеребцов, собак, хряков, кроликов,птиц и рыб. Успешно разрабатываются методы криоконсервации спермы различных видов диких животных. При этом важное значение при замораживании имеет предупреждение загрязнения спермы патогенной микрофлорой. Обнаружено, что в жидком азоте возможно перенесение от гранулы к грануле как спермиев, так и микроорганизмов. Так,уже через 3 недели после дезинфекции сосуда Дьюара и использования его для хранения спермы в жидком азоте в нем были обнаружены возбудители заразных заболеваний . , патогенные стрептококки, огромное количество стафилококков, ,и целый ряд других,(Криоконсервирование клеточных суспензий. Киев. Наукова думка 1983 г. Глава 12 с. 187). Суть способа заключается в том, что из нержавеющего стального листа высотой 13 см,диаметром 4 см, толщиной стенки- 0,08 мм, с круглыми отверстиями в стенке диаметром 0,4 мм и на донышке с отверстиями 0,1 мм (для доступа жидкого азота),изготавливается канистра вместимостью 100 соломинок - паетов . Канистра прикрепляется к измерительной линейке, для определения уровня жидкого азота. Сперму после получения, оценки и разбавления расфасовывают в соломинки, эквилибрируют 15-20 мин, при комнатной температуре, маркируют, помещают в холодильник для охлаждения в течение 1,5-2 час. Соломинки вкладываются в охлажденную канистру,заморозка начинается на уровне 7 см. от поверхности жидкого азота, измерив его мерной линейкой непосредственно в горловине сосуда Дьюара. Канистра с соломинками постепенно опускается со скоростью 1 см. за 1 минуту и после касания поверхности полностью погружается в жидкий азот. После замораживания соломинки 2 переносят в канистры сосуда Дьюара для хранения и банка спермы. Известен способ замораживания спермы в виде гранул на поверхности сухого льда или на фторопластовой пластине (Структура и функция спермиев сельскохозяйственных животных при криоконсервации. Наук В.А. Кишинев, Штиинца,1991, с. 199). Недостатком данного способа является высокий расход жидкого азота за счет испарения во время расфасовки гранул на поверхности фторопластовой пластины. Способ не защищен от загрязнения и механических повреждении спермиев,так как имеет открытую поверхность, а также неодинаковый объем гранул. (Структура и функция спермиев сельскохозяйственных животных при криоконсервации. Наук В.А. Кишинев. Штиинца, 1991.с. 199.) Известен способ замораживания спермы в полипропиленовых соломинках (Курбатов А.Д Платов Е.М, Корбан Н.В. и др. Криоконсервация спермы сельскохозяйственных животных. ЛВОАгропромиздат, 1988, с.183-181). В этом способе разбавленную сперму фасуют с помощью вакуумной камеры в полипропиленовые соломинки диаметром 2 мм, вместимостью 0,25 мл. после фасовки соломинки раскладывают в специальный штатив- рамку, который ставят в холодильник на 3-4 часа для постепенного охлаждения до 2-4 С, после чего помещают на медную, охлажденную до 120160 С пластину. Соломинки опускают на пластине в широкогорлый сосуд, диаметр горловины которого составляет 50-60- см на расстояние 4-6 см от поверхности жидкого азота. Через 5-6 минут соломинки собирают со штатива и погружают для хранения в азот. Данный способ имеет ряд недостатков - так как требуется наличие вакуумной камеры и вакуумного насоса, медной пластины, а также широкогорлого сосуда, что приводит к нерациональному испарению большого количества жидкого азота. (Способ криоконсервации спермы сельскохозяйственных животных и установка для его осуществления. В.М.Зорин, М.В.Зубец,А.В.Зорин и Н.М.Зубец. Украинский научноисследовательский институт по племенному делу в животноводстве) Известен способ криоконсервации спермы сельскохозяйственных животных и установка для его осуществления(В.М.Зорин,М.В.Зубец,А.В.Зорин, Н.М.Зубец. 1993 г.Украинский научноисследовательский институт по племенному делу в животноводстве). При этом способе применяется установка, включающая в себя теплоизолированную камеру, сообщающуюся через патрубок с сосудом Дьюара. Внутри камеры расположен привод регулятора скорости вращения барабана, на котором установлены тубы со спермодозами. В герметичной камере загруженные в тубы спермодозы при температуре 2, 5 С подвергаются эквилибрации, а также в течение 1-2 ч и замораживанию парами жидкого азота, подаваемого в камеру. При этом тубы со спермодозами вращают со скоростью 180250 об/мин при скорости замораживания от 3 до 30 град/мин. По достижении температуры туб со спермодозами (-)30 и (-)60 С замораживания ведут при скорости 5-35 град/мин при (- )60 и (-)90 С -1040 об/мин при(-)90 град Цельсия -5-10 об/мин. Последующее охлаждение спермодоз ведут до достижения температуры от (-)100 до (-) 150 С. К недостаткам способа следует отнести сложность процесса замораживания, продолжительностью во времени и затраты энергии, а также потребность дополнительного дорогостоящего оборудования,камеры, вращающегося барабана с регулятором скорости, тубы, программного датчика, вакуумной установки. (Способ криоконсервации спермы сельскохозяйственных животных и установка для его осуществления. В.М.Зорин, М.В.Зубец,А.В.Зорин и Н.М.Зубец. Украинский научноисследовательский институт по племенному делу в животноводстве) Прототипом нашего способа является метод замораживания спермы в соломинках(МалмаковН.И,Асылбекова Г.К.Научнопроизводственный центр животноводства и ветеринарии РК). Из корпуса пластикового шприца изготавливается канистра прикрепленная к измерительной линейке, а из поршня шприца сделан штатив для 16 соломинок. Недостатком этого способа является то, что одновременно за один прием замораживается только шестнадцать проб спермы (соломинок), чтобы заморозить большее число проб спермы необходимо потратить много времени. К тому же пластиковый одноразовый шприц не рассчитан для многократного использования. Пластиковый шприц не пригоден для использования, как в очень низких, так и в очень высоких температурах продолжительное время.(Способ замораживания спермы баранов в соломинках Малмаков Н.И, Асылбекова Г.К. Научно-производственный центр животноводства и ветеринарии.МСХ РК) Целью данного изобретения является упрощение технологии замораживания,одновременная криоконсервация максимального количества спермы в соломинках, экономия времени, жидкого азота,снижения затрат, защита от загрязнения спермы и предохранение от воздействия внешних патогенных факторов, повышение сохранности спермиев после размораживания. Задачами данного изобретения ставились Изучение количественных и качественных показателей свежеполученной спермы козлов с использованием современных методов анализа. Количественный и качественный анализ спермы козлов при использовании различных криопротекторов и при различных режимах криконсервации, создание банка спермы козлов производителей. В экспериментах использовались два криопротектора ВИЖ и . Криопротектор ВИЖ. Для разбавления спермы использовался унифицированная, единая для всех видов животных среда, которая состоит из шести основных компонентов сахарозы, комплексонатов кальция и магния, антиоксиданта, желтка куриного яйца, криопротектора и антибиотика.(Сахароза составляет 80 унифицированной среды. Из-за различий в осмолярности плазмы спермы животных разных видов концентрация сахарозы в растворе изменяется. Для спермы концентрация сахарозы в растворе составляет 12 . Концентрация комплексонатов кальция и магния в среде для разбавления спермы должна составлять по 0,3 на 100 мл. В качестве антиоксидантов применяют ди-трет-бутилкрезол в количестве 0,0005 г на 100 мл. Желток куриного яйца должен составлять 4-5 среды. В качестве криопротектора использовался глицерин, который составляет 4-5. Санирующие средства представлены антибиотиками. Состав унифицированной среды следующий Сахароза. Отдельный раствор соответственно виду животных в 1 л дистиллированной воды. Этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль кальциевый комплекс 6-водная, г-3,0 Этилендиаминтетрауксусной кислоты дикалиевая соль, магниевый комплекс - водная, г-6,8 Перед разбавлением среда обязательно была проверена на пригодность методом смешивания капель (сперма-среда), подвижность спермиев после разбавления должна быть не ниже, чем до смешивания спермы со средой. Разбавление семени криопротектором проводился в соотношении 13 соответственно. После разбавления подвижность спермиев не должна снижаться. Криопротектор . Состав криопротектора Трис ( 121), г-7,0 Так же, перед разбавлением среда обязательно проверялся на пригодность методом смешивания капель (сперма-среда), подвижность спермиев после разбавления должна быть не ниже, чем до смешивания спермы со средой. Разбавление семени криопротектором проводился 200 млн.кл/мл. После разбавления подвижность спермы не должна снижаться. Разбавленную сперму расфасовали с помощью вакуумной камеры в силиконовые соломинки вместимостью 0,5 мл(,). После расфасовки спермы открытые концы соломинок герметизировали с помощью специального клея и раскладывали в штатив-рамку, которую ставили в холодильник на 2 3 часа для постепенного охлаждения до 4 С. Затем соломинками наполнили канистру-устройство и опускали в сосуд Дьюара на расстояние 7 см от поверхности жидкого азота. Через каждые 60 сек. канистру с соломинками опускали к поверхности жидкого азота на 1 см. Через 7 минут канистру с соломинками погружали в жидкий азот полностью. Вытащив, из канистры-устройства замороженные соломинки со спермодозами перекладывали в визотубы контейнеров и дальше в канистры сосуда Дьюара на хранение и создания банка спермы. При применении этого метода охлаждения нами достигался определенный режим охлаждения при криоконсервации сперматозоидов, Фиг.1. Оттаивали сперму быстро. Соломинки с замороженным семенем помещали в водяную баню при температуре 38-40 С. Для осеменения козоматок требуется 0,2 мл спермы, содержащей не менее 80 млн.спермиев. Проводили анализ подвижности сперматозоидов с применениеманализатора( ,), что позволило получить новые, абсолютно объективные количественные и качественные показатели спермы. Показатели качества спермы для данного способа выше, чем у аналогов. Таким образом,предлагаемый способ позволит упростить технологический процесс криоконсервации и снизить затраты, экономить время на весь процесс замораживания. Существенным отличительным признаком заявляемого способа от наиболее близкого аналога является то, что для повышения качества замороженной спермы, снижения затрат используют канистру из нержавеющего стального листа, вместимостью 100 соломинок. На основе испытания различных сочетаний криопротекторов,различных режимов замораживаия установлены оптимальные способы криоконсервации сперматозоидов коз. Образцы спермы собирали с применением электроэякулятора. Экспериментально доказано возможность получения качественных сперматозоидов коз. Создан экспериментальный криобанк сперматозоидов разных возрастов и пород коз Казахстана. Анализ количества сперматозоидов у козлов разных возрастов показал незначительное различие в концентрации сперматозоидов (1,5 и 4,5 лет) 3983,621750,35 и 3720,99792,85, соответственно. Установлено, что у 1,5 годовалых козлов количество подвижных сперматозоидов составило 1,820706,73/мл и количество сперматозоидов с прогрессивной подвижностью -693117,83, у 4,5 летних козлов количество подвижных сперматозоидов составило 2960,56676,00/мл и количество сперматозоидов с прогрессивной подвижностью - 1406,53423,72. Установлены процентные соотношения подвижных сперматозоидов и сперматозоидов с прогрессивной подвижностью, которые у 1,5 годовалых составило 48,0 и 23,0, 4,5- годовалых козлов -78,5 и 35,75, соответственно. На основе анализа процентного соотношения подвижных сперматозоидов и сперматозоидов с прогрессивной подвижностью были отобраны козлы использованные в качестве доноров семени. По количеству сперматозоидов с быстрой скоростью движения взрослые козлы превосходят молодых на 63, а по количеству сперматозоидов со средней скоростью -47. В то же время определено, что по количеству неподвижных (мертвых) сперматозоидов молодые козлы в три с лишним раза превосходили взрослых. Схематическое (фиг.2), фотографическое ( фиг.3), при криоконсервации (фиг.4) изображения устройства показаны, ниже по тексту ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ криоконсервации спермы козловпроизводителей, включающий получение спермы,разбавление, расфасовку в соломинки, маркировку,помещение соломин в канистру, отличающийся тем, что при разбавлении спермы со средой используют криопротекторы ВИЖ и ,расфасовку спермы проводят с помощью вакуумной камеры в силиконовые соломинки вместимостью 0,5 мл (, ), открытые концы соломинок герметизируют с помощью клея и раскладывают в штатив-рамку, помещают в холодильник на 2 часа, охлаждают до 4 С, при этом используют канистру из нержавеющего стального листа вместимостью 100 соломинок.